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肝细胞癌(简称肝癌)是全球发病率排名第五的癌症,具有很高的致死率,在癌症造成的死亡中排名第三。由于肝癌在确诊时往往已发展到中晚期,失去了手术的时机。临床上常用的化疗药物靶向性差,具有很大的毒副作用,而且肝脏作为人体最大的解毒器官,很容易出现耐药性的问题,因此传统的化疗对肝癌的治疗效果有限。纳米药物的兴起为肿瘤的治疗提供了新的思路,利用纳米药物对肿瘤组织独特的EPR(permeability and retention, EPR)效应和易于靶向修饰的特点,可以实现对肿瘤的选择性杀伤。三维纳米石墨烯(three dimensional nanographene,以下简称NG)是国家纳米药物工程技术研究中心在三蝶烯分子上三取代六苯并蔻合成的一类新型纳米材料,它具有独特的荧光性能、大共轭体系和超分子自组装性能。我们选择肝癌细胞系HepG2和正常肝细胞系HL7702为研究对象,对NG的细胞生物学效应进行初步探索,主要研究内容和结果如下：1)以THF为溶剂,通过溶剂挥发法制得了NG纳米粒水溶液。动态光散射法测得NG纳米粒的粒径为169nm,PDI为0.019。TEM显示NG纳米粒为直径50nm的球体。荧光光谱扫描的结果显示NG纳米粒在360nm-420nm区域有强激发,在470、500和556nm处有三个发射峰。2)采用MTT法评价了NG纳米粒对HepG2细胞和HL7702细胞的毒性,结果发现NG纳米粒能够选择性杀伤HepG2细胞,而对HL7702细胞毒性较小。克隆形成实验表明NG纳米粒在低浓度下能选择性抑制HepG2细胞的生长。Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法显示NG纳米粒是通过凋亡造成细胞死亡的。Western blot的结果显示凋亡过程中发生了PARP的裂解,而且HepG2细胞中γ-H2AX水平增加,表明细胞中发生了DNA双链的断裂。3)为了研究NG纳米粒的选择性细胞毒性是否与不同的细胞摄取效率和内吞途径有关,我们使用激光共聚焦显微镜观察细胞摄取纳米粒的过程,并用荧光分光光度计对进入胞内的纳米粒进行定量。结果表明HepG2细胞对NG纳米粒的摄取效率比HL7702细胞更高。我们进一步通过内吞抑制剂研究了两种细胞摄取NG纳米粒的内吞途径,结果发现HepG2细胞主要通过网格蛋白介导的内吞途径摄取NG纳米粒,而网格蛋白介导的内吞和小窝蛋白介导的内吞共同参与了HL7702细胞对NG纳米粒的摄取。共定位的结果表明两种细胞摄取的NG纳米粒都转运到了溶酶体和高尔基体,而且HepG2细胞中有部分NG纳米粒定位于线粒体。4)为了进一步揭示NG纳米粒特异性杀伤HepG2细胞的机理,我们比较了NG纳米粒刺激下两种细胞内氧化压力的变化。结果显示HepG2细胞具有更高的基础ROS水平,在受到NG纳米粒刺激后产生大量的活性氧(reactive oxygen species ROS),HL7702细胞仅产生少量的ROS。此外,NG纳米粒更容易耗竭HepG2细胞内的谷胱甘肽(GSH)。抗氧化剂N-乙酰-半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)不仅能够抑制NG纳米粒导致的ROS积累和GSH的消耗,而且能够逆转NG纳米粒诱导的细胞凋亡。基于线粒体在产生ROS中的重要作用,我们用荧光探针JC-1检测了两种细胞在NG纳米粒影响下线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)的变化,结果显示HepG2细胞的MMP在NG纳米粒作用下迅速丧失,而HL7702细胞MMP的下降较小,抗氧化剂NAC能恢复NG纳米粒诱导的MMP下降,这说明NG纳米粒导致的线粒体损伤是造成ROS累积的重要原因。5)为了进一步揭示NG纳米粒产生ROS诱导细胞凋亡的分子机制,我们研究了HepG2细胞内氧化还原敏感的转录因子在NG纳米粒诱导下活性的变化。结果表明在NG纳米粒刺激下HepG2细胞内核转录因子-κB (NF-κB)、活化蛋白-1(AP-1)和p53的活性受到了显著的激活,而且这种激活作用可以被NAC抑制。我们详细研究了NF-κB在NG纳米粒诱导HepG2细胞凋亡中的作用及其机理,发现转染野生型IKKa和IKKβ能增加NG纳米粒诱导的NF-κB激活,而转染IKKα和IKKβ的负显性突变体(IKKα K44A和IKKβ K44A)能减轻NG纳米粒诱导的NF-κB激活。进一步通过转染IKK的负显性突变体或者IKK的化学抑制剂小白菊内酯都能增加HepG2细胞对NG纳米粒的敏感性,表明IKK/NF-κB信号通路参与NG纳米粒诱导HepG2细胞凋亡的作用,且NF-κB在NG纳米粒诱导的细胞凋亡中起着抗凋亡的作用。本文发现NG纳米粒能够选择性诱导HepG2细胞凋亡,而对HL7702细胞毒性较小,提示我们新型碳纳米材料NG在肝癌治疗中具有潜在价值。进一步的研究证明了NG纳米粒的细胞毒性是通过诱导细胞产生ROS产生的,而且两种细胞敏感性的差异有两方面原因：首先是两种细胞对NG纳米粒的内吞途径不同导致了摄取效率的差异,其次是由于HepG2细胞具有更高的基础氧化压力,进一步的氧化刺激很容易超过细胞的抗氧化阈值,导致细胞氧化平衡体系崩溃。这些结果为我们利用纳米药物治疗肿瘤提供了新的思路,可以概括为细胞对纳米粒的选择性摄取和ROS介导的细胞凋亡。利用NG纳米粒治疗肿瘤还有很多工作要做,例如纳米粒组装的具体机制、对其他细胞的毒性规律、细胞内作用的分子位点以及纳米粒在体内的分布动力学和抗肿瘤效果。