蛋白质酪氨酸硝化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,硝化修饰会导致酪氨酸残基附近局部空间位阻增加,酚环羟基pKa值降低,蛋白质负电荷密度增加并最终影响蛋白质的结构与功能。蛋白质硝化在机体内很常见,蛋白质硝化水平增高与许多疾病,如心血管疾病、糖尿病和神经退行性疾病等的发生发展具有密切联系。因此,研究机体内重要蛋白的硝化修饰对理解相关疾病的发病机制及预防和治疗具有重要意义。由于化学方法造成的多肽酪氨酸硝化,不可避免会同时引入多肽的氧化,使得研究硝化对多肽结构和功能的影响难以进行。本文选取了两条功能明确,其中酪氨酸残基对其功能有明确或潜在影响的多肽,即神经肽Y（neuropeptide Y,NPY）和人降钙素（human calcitonin,hCT）,通过定制合成的方法,将其中的酪氨酸残基替换成3-硝基酪氨酸,具体研究酪氨酸硝化对其结构和功能的影响。NPY是一种可调节中枢神经系统中多种生理功能的活性多肽,与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）有密切关联。NPY结构中含有多个酪氨酸残基,而AD中氧化和硝化水平增高。因此,NPY也有可能发生硝化修饰,导致它在AD中功能异常。然而关于它具体的硝化情况及硝化对NPY结构与功能的影响并无研究报道;hCT是一种曾广泛用于治疗骨吸收相关疾病但由于其高聚集性而被弃用的活性肽,而本课题组前期研究发现硝化可以抑制淀粉样多肽聚集并且研究表明hCT中酪氨酸残基在其聚集中扮演着重要角色,硝化能否成为一种抑制hCT聚集而保留其活性的新颖方法值得研究。本文探讨了NPY硝化的成因,研究了硝化对NPY与hCT结构和功能的影响,取得了以下研究成果:（1）证明了血红素可与NPY结合并催化NPY硝化,且NPY硝化影响其结构与功能:紫外可见光谱、荧光光谱和差示脉冲伏安法结果表明NPY可以和血红素结合,并且这种结合可以显著提高游离血红素的过氧化物酶活性。斑点印迹结果表明在过氧化氢和亚硝酸盐存在的情况下,NPY与血红素结合后极容易发生硝化。LC-MS/MS结果证明了NPY中与神经肽受体结合和激活具有重要作用的Tyr36在上述硝化过程也会发生硝化。36号位酪氨酸定点突变为3-硝基酪氨酸后,会严重破坏NPY的活性单体结构并显著削弱其生物活性。这些结果表明NPY也许是经由与血红素作用引起自身硝化而削弱它在神经系统中的功能进而与AD的发生发展相紧密联系。（2）证明了铜离子可与NPY结合并催化其硝化:电化学、ESI-MS和光谱技术检测结果表明铜离子能与NPY结合形成一种具有低解离常数（K_d⁰.021μM）的复合物。羟基自由基检测的结果表明NPY与铜离子结合会促进·OH的产生,增强局部的氧化应激。斑点印迹结果证明在Cu²⁺-NO₂^--H₂O₂体系下,NPY同样可以很容易发生硝化。LC-MS/MS结果显示,在此条件下,NPY中的所有酪氨酸残基均发生了硝化,而Tyr36的硝化将会导致NPY的生物活性降低。该研究结果表明NPY也有可能经由与铜离子的相互作用,使自身发生硝化修饰,影响其生理功能。（3）发现酪氨酸硝化修饰显著抑制hCT聚集,有效保持其生物活性:荧光光谱、荧光电镜和透射电镜结果显示12号位酪氨酸硝化可以显著抑制hCT聚集。Nu-PAGE凝胶电泳和圆二色光谱结果表明硝化修饰不仅可以抑制hCT聚集还可以在较长时间内使它保持单体的形式。此外,采用氯化的hCT作为参照,发现氯化修饰并没有影响其聚集。这些结果表明酪氨酸硝化修饰很可能是通过增加局部空间位阻以破坏hCT分子之间的堆叠,从而实现抑制聚集的作用。最后,动物实验结果表明,12号位酪氨酸硝化修饰对hCT生物活性并没有太大的影响,而且可以在较长时间内维持其降钙活性。该研究结果将对设计高度同源性的hCT类似物药物具有重要指导意义。（4）发现血红素显著抑制hCT聚集,有效保持其生物活性:紫外光谱、差示脉冲伏安和等温滴定量热结果表明血红素可以以一种适度的亲和性与hCT结合,并且该结合具有可逆性。荧光探针,透射电镜,原子力显微镜,Nu-PAGE凝胶电泳和圆二色光谱结果均表明血红素可以显著抑制hCT聚集,并且这种抑制作用很可能是通过结合后,血红素的大环阻碍hCT分子核心聚集区域的π-π堆积而实现的。动物实验结果显示,经血红素处理的hCT,24小时后仍然保持它原有的降钙活性,而未经处理的hCT,由于发生聚集,其降钙活性显著降低。该发现对发展一种最佳的hCT制剂及使hCT重返临床应用具有重要意义。