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胆固醇具有多种益生功能,是人体不可或缺的重要营养成分,但过量摄入胆固醇会引起心脑血管疾病,严重危害人体健康。临床上,常规治疗药物具有多种副作用,人们希望寻找一种更有效更安全的手段去降低胆固醇。研究表明,植物乳杆菌能够降低血清中的胆固醇,并减少心脑血管疾病发病率。目前,许多研究团队针对植物乳杆菌的降胆固醇特性进行了体内外实验,旨在研究其作用机理。植物乳杆菌降胆固醇的机理包括共沉淀作用、同化作用、胞外多糖的吸附作用等。本论文以两株具有不同降胆固醇能力的植物乳杆菌Lp10和Lp11作为实验材料,首先,对降胆固醇过程的关键酶胆盐水解酶基因（bshs）进行克隆、生物信息学分析、异源表达,并在转录水平上测定胆盐水解酶的表达量,结果表明:bsh1、bsh2、bsh3、bsh4大小分别为975bp、1017bp、987bp、954bp,构建的表达载体pET-32a-bshs在大肠杆菌BL21（DE3）中都成功表达,蛋白质分子量大小都约为37KDa,其中只有BSH3是可溶性表达,BSH1、BSH2、BSH4均表达为无活性的包涵体。对BSH3的粗酶液上清进行纯化,得到单一条带,纯化效果良好,测定其酶活,发现无活性。随后,在胆盐条件下,利用荧光定量PCR测定胆盐水解酶基因表达量,结果表明bsh1和bsh2相对表达量分别上调7.303倍和4.256倍,bsh3和bsh4相对表达量下调1.805倍和3.247倍,即胆盐水解酶基因在降胆固醇过程中发挥主要作用的是bsh1,其次是bsh2,而在此过程中bsh3和bsh4基因的表达反而受到抑制。为了避免共沉淀作用的干扰,在不添加胆盐条件下,利用转录组测序技术对植物乳杆菌其他降胆固醇机理进行了探索。转录组测序结果共产出3.12×10100 bp数据量,原始测序数据质量合格,与参考基因组植物乳杆菌ST-III比对,所有样品mapping率都高达99%。对测序数据进行表达差异分析,在Lp10MvsLp10CM比较组中共有304个显著差异基因,其中79个上调基因,225个下调基因,Lp11MvsLp11CM比较组中共有272个显著差异基因,其中127个上调基因,145个下调基因,在两个比较组中,有85个相同的显著差异基因。对显著差异基因进行GO和KEGG富集分析,果糖和甘露糖代谢通路与植物乳杆菌的胞外多糖吸附作用降胆固醇机理有关,确定此代谢通路中的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶（L-rhamnulose-1-phosphate aldolase,rhaD）为降胆固醇关联基因,并对其进行荧光定量PCR验证,结果表明rhaD基因在降胆固醇过程中相对表达量下调1.140倍,与转录组数据结果一致。分析转录组数据中胆盐水解酶的表达情况,发现bsh1、bsh2、bsh3、bsh4的表达均不显著,说明胆盐水解酶必须在胆盐的存在下进行共沉淀作用,并且在不同处理条件下,植物乳杆菌的发挥主要作用的降胆固醇机理不同。最后,利用同源重组原理,构建pNZ5319-rhaD敲除质粒,电击转化植物乳杆菌Lp10感受态细胞,对rhaD基因进行敲除,结果表明:敲除载体pNZ5319-rhaD构建成功,测序结果证实rhaD基因被成功敲除。为了验证rhaD基因的功能,对原始菌株和敲除菌株进行了生长曲线、降胆固醇能力、耐酸性、耐胆盐性、疏水性、抗氧化性、EPS含量等理化指标的测定。结果表明:敲除载体较原始菌株生长缓慢,两株菌在pH值为2.5和3.0时,生长情况一致,pH值为3.5时,原始菌株的耐酸能力更好;原始菌株的疏水性为32.2%,敲除菌株为8.9%,原始菌株的疏水性更好;利用邻苯二甲醛法测定降胆固醇能力,原始菌株的胆固醇降解率为18.96%/OD600,敲除菌株的胆固醇降解率为19.22%/OD600,显著下调基因rhaD经敲除后,敲除菌株的降胆固醇能力略有上升,且EPS含量增加,与转录组数据分析一致。本实验从多方面分析降胆固醇关键酶胆盐水解酶,并从转录水平上挖掘与降胆固醇有关的显著差异基因,研究在不同处理条件下,植物乳杆菌降胆固醇机理的差异性。本论文不仅为研究植物乳杆菌降胆固醇机理提供新思路,也为功能性乳酸菌制品的开发提供理论依据。