一、西米特酸诱导人早幼粒细胞白血病HL-60凋亡的研究 1．西米特酸对HL-60细胞的生长抑制作用黄色的MTT可以被活细胞中的琥珀酸脱氢酶代谢为蓝紫色的甲瓒产物，并且其生成量与存活的细胞数成正比，经DMSO溶解后呈紫色或淡紫色，根据颜色的深浅可判断活细胞的多少。 2．西米特酸诱导HL-60细胞凋亡 2.1形态学改变 1μg/ml西米特酸处理HL-60细胞36h后，Hoechst33258染色可见染色质浓集，并可见凋亡小体，而对照组无染色质的浓集和凋亡小体的产生，这从形态学上说明西米特酸诱导HL-60细胞发生了凋亡。 2.2 DNA非随机性降解DNA非随机性降解是细胞凋亡的重要生物化学标志 2.3流式细胞仪检测细胞周期是指一个连续分裂的细胞从一次分裂完成开始，到下一次分裂完成为止所经历的全过程，可分为G<,0>期、G<,1>期、S期、G<,2>期、M期。肿瘤的一个基本特征是细胞周期调控机制的破坏，导致细胞的失控性生长。 2.4西米特酸处理HL-60细胞后，capase-3被活化并剪切其下游的PARP，进而诱导细胞凋亡。 2.5 Western blot结果同样显示，DEVD-CHO可阻断了西米特酸诱导HL-60细胞PARP断裂带的产生，表明西米特酸诱导的HL-60细胞的凋亡依赖于caspase-3的功能。 3．西米特酸诱导HL-60细胞凋亡的机制 3.1西米特酸对周期调控蛋白p16、p27的影响 p16和p27基因是参与调控肿瘤细胞周期重要的抑癌基因，其表达水平低下或缺失，可导致细胞过度生长，引起肿瘤发生，而在药物诱导肿瘤细胞凋亡时常有p16和p27的重新激活。 3.2西米特酸对HL-60细胞c-myc的影响 c-myc是一种原癌基因，在调节DNA合成、细胞凋亡、分化及细胞周期的进行中起重要作用。在许多肿瘤中，该基因是决定细胞从G<,0>/G<,1>期进入S期的开关。c-myc蛋白是一种螺旋-环-螺旋亮氨酸的拉链蛋白，在细胞由正常转向肿瘤性生长过程中起到了至关重要的作用，其过度表达可使细胞无限增殖，获永生化功能，促进肿瘤发生发展。 3.3西米特酸对HL-60细胞PI3K磷酸化水平的影响 PI3K信号途径的异常激活在肿瘤中起着重要的作用。结果显示，PI3K的总量不变化，而其磷酸化水平则逐渐降低。 3.4西米特酸对HL-60细胞AKT磷酸化水平的影响 Akt是PI3K下游最重要的信号分子，磷酸化的Akt可以激活下游靶分子，进而发挥其细胞生存和抗凋亡作用。结果显示，Akt的总量无变化，而Akt的磷酸化水平则随着时间的延长逐渐降低，这与其上游分子PI3K的磷酸化水平改变趋势基本相同。 4．西米特酸诱导HL-60细胞凋亡其他可能的机制为进一步阐明西米特酸诱导HL-60细胞凋亡的机制，结果显示1μg/ml西米特酸处理HL-60细胞24h和4 8h后p73、JunD、GADD45A、PPP1R15A、TNFAIP3等多种基因表达升高，MAP2K5、IGF2R等多种基因表达降低。为验证基因芯片的结果，我们用RT-PCR法检测了部分基因的mRNA的改变情况。如图所示，1μg/ml西米特酸处理HL-60细胞24h和48h后p73、JunD、GADD45A、PP1R15A、TNFAIP3的mRNA表达增高，而MAP2K5、IGF2R的mRNA表达水平则降低，这个结果与基因芯片的结果相吻合。有研究证明，p73可转录激活p53应答基因，引起细胞周期抑制、分化和诱发细胞凋亡，Gong等的研究表明，p73可不依赖于p53功能、被非受体酪氨酸激酶通过ATM磷酸化进而发挥细胞周期抑制和诱导凋亡的作用，我们进一步检测西米特酸诱导HL-60细胞凋亡的过程中，p73蛋白水平是否改变。Western blot结果显示，1μg/ml西米特酸处理HL-60细胞后，P73蛋白水平均比对照组高，表明p73蛋白可能参与西米特酸诱导HL-60细胞凋亡过程。 二、西米特酸诱导Hep3B细胞发生自噬性死亡的研究 1、西米特酸对Hep3B细胞的生长抑制作用首先，我们用MTT法检测了西米特酸对Hep3B细胞增殖的影响。以0.125、0.25、0.5、1和2μg/ml西米特酸处理Hep3B细胞72h，对Hep3B细胞的生长抑制率分别为10.4﹪、12.4﹪、 23.3﹪、89.1﹪和96.6﹪，与对照组相比，该药能明显抑制Hep3B细胞的增殖(P<0.05)，并呈浓度依赖性，其IC<,50>为0.57μg/ml。这说明西米特酸在体外能显著抑制Hep3B细胞的增殖。 2、西米特酸对Hep3B细胞caspase-3和PARP的影响上文已证明西米特酸对Hep3B细胞有较强的抑制作用。但是否可诱导Hep3B细胞凋亡尚不清楚。取对数生长期的Hep3B细胞，以1μg/ml西米特酸处理Hep3B细胞6h，12h，24h，36h，48h后，caspase-3和PARP蛋白并无明显改变，也无凋亡时典型的断裂带的产生，表明，西米特酸诱导Hep3B死亡不是通过细胞凋亡方式实现，可能是通过其他的细胞死亡方式。 3、西米特酸诱导Hep3B细胞发生自噬性死亡 3.1 丫啶橙(Acridine orange)染色上文已排除西米特酸诱导Hep3B细胞为非凋亡性死亡。Aridine orange(AO)是可以染色细胞内的酸性小体，如溶酶体等。细胞发生自噬时，因溶酶体参与形成自噬溶酶体，致使pH值升高，胞内的酸性小体减少，因此AO染色可作为一种自噬的指示剂。我们以1μg/ml西米特酸处理Hep3B细胞36h后，以AO染色，结果表明，在西米特酸处理Hep3B细胞36h后，酸性小体(红色)比对照组明显减少，细胞呈现圆形、胞浆淡绿色改变，表明溶酶体等酸性小体减少、酸性被中和，提示自噬可能是西米特酸诱导Hep3B细胞死亡的方式。 3.2 Monodansylcadaverine染色 Monodansylcadaverine(MDC)是细胞自噬特异性的染色剂，在紫外激发下，自噬小体呈现蓝色。1μg/ml西米特酸处理Hep3B细胞36h后，以MDC染色10min，激光共聚焦显微镜下紫外光激发，结果显示，在西米特酸处理Hep3B细胞36h后，细胞内出现明显的蓝色小体，表明西米特酸诱导Hep3B细胞死亡是一种自噬性细胞死亡。 3.3西米特酸对LC3-Ⅱ的影响 LC3是哺乳动物细胞中酵母Atg8基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是细胞自噬泡膜的通用标记物。细胞中新合成的LC3经过加工，成为胞浆可溶性LC3-Ⅰ，后者经泛素样加工修饰过程，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合，形成LC3-Ⅱ，其含量的多少反映了细胞的自噬活性。 4、西米特酸诱导Hep3B自噬的机制 4.1 西米特酸对PI3K磷酸化水平的影响 Hep3B细胞中PI3K/AKT信号途径被异常激活，有研究表明，细胞自噬过程中常有PI3K/AKT信号通路的参与。为检测西米特酸诱导Hep3B细胞自噬过程中PI3K途径是否受影响，我们用1μg/ml的西米特酸处理Hep3B细胞6h、12h、24h、36h、48h等不同时间后，Western blot方法检测PI3K的磷酸化水平。结果显示，PI3K的总量不变化，而其磷酸化水平则逐渐降低。表明西米特酸诱导Hep3B细胞自噬过程中有PI3K的抑制。 4.2 西米特酸对Akt磷酸化水平的影响上文已证实西米特酸诱导Hep3B自噬性死亡时磷酸化PI3K水平逐渐降低，我们进一步检测PI3K下游分子Akt是否发生改变。用1μg/ml的西米特酸处理Hep3B细胞6h、12h、24h、36h、48h后，Western blot检测显示，随时间的推移Akt磷酸化水平逐渐降低，而Akt总量无改变，表明Akt可能参与了西米特酸诱导Hep3B发生自噬性死亡的过程，并且其变化趋势与磷酸化的PI3K的变化一致。 4.3西米特酸对FKHR和mTOR磷酸化水平的影响 FKHR和mTOR是Akt下游重要的分子，活化的AKT通过磷酸化多个靶蛋白使它们失活传递存活信号，失活转录因子FKHR，磷酸化mTOR使得细胞存活、增殖等。mTOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器，对细胞生长具有重要调节作用，也是自噬的负调控分子，通过抑制mTOR的活性，可诱导自噬的发生。在以1 μ g/ml的西米特酸处理Hep3B细胞6h、12h、24h、36h、48h后，Western blot检测显示，FKHR和mTOR的磷酸化水平均逐渐减少，表明FKHR和mTOR可能参与了西米特酸诱导Hep3B细胞自噬性死亡的过程。 5、西米特酸诱导Hep3B细胞自噬的其它机制为探讨西米特酸诱导Hep3B自噬是否有其它通路参与，我们研究了Hep3B对STAT通路的影响。正常细胞中STAT信号通路被激活是瞬时的过程，而在许多肿瘤中则是持续激活。持续激活的STAT3通过抗凋亡和诱导细胞增生的作用参与肿瘤的发生发展。以1μ g/ml的西米特酸处理Hep3B细胞6h、12h、24h、36h、48h后，Western blot法检测显示，Hep3B中磷酸化的STAT3水平很高，随着时间推移，其磷酸化水平逐渐减少，表明STAT3可能参与了西米特酸诱导Hep3B细胞自噬性死亡的过程。