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全球范围内,乳腺癌发病率与死亡率逐年上升,2020年全球癌症报告显示女性乳腺癌发生率高达24.5%,严重威胁女性健康。目前常见的乳腺癌治疗方式（如手术切除、放疗、化疗、靶向药物治疗、内分泌治疗等）在缓解病情的同时,其毒副作用经常会给患者身体及心理健康带来不同程度的伤害,因此越来越多的学者将目光转移到低毒副作用的天然药物上来。生物多糖广泛存在于动物、植物及微生物体内,是一种具有抗肿瘤、抗氧化、提高机体免疫力等多种药理活性的天然药物。九香虫Aspongopus chinensis Dallas,1851是一种具有药食两用价值的资源昆虫;研究表明,九香虫血淋巴、甲醇提取物、水煎液、水提液、纯化蛋白等物质对乳腺癌、胃癌、肝癌等多种癌症具有显著的抑制作用,然其具体成分多不明确。因此,本研究拟对九香虫多糖（Aspongopus chinensis polysaccharides,APs）提取条件进行探索,并利用九香虫多糖开展体外抗乳腺癌活性研究以及作用机制的初步探索。具体实验方法及结果如下:1、九香虫多糖提取条件筛选为得到九香虫多糖APs并提高APs提取率,采用水提醇沉法提取,以APs提取率为考察指标,通过单因素实验和正交试验探究APs的最优提取条件。结果表明,影响APs提取率的四种因素主次顺序为:提取次数＞液料比＞提取时间＞提取温度。APs提取的最佳条件为:液料比40 m L/g、提取温度90℃、提取时间3 h、提取次数3次,在此条件下APs提取率为5.067±0.024%。为去除APs中的游离蛋白,采用Sevage法除蛋白得到九香虫除蛋白多糖（Aspongopus chinensis protein-removed polysaccharides,APRP）,通过苯酚硫酸法和Bradford法分别测定APs和APRP的总糖含量和蛋白含量,计算蛋白去除率和总糖保留率分别为:20.7371±2.0346%、93.5553±0.3179%。2、九香虫多糖体外抗乳腺癌活性研究（1）九香虫多糖APs和九香虫除蛋白多糖APRP对乳腺癌细胞增殖的影响为对APs和APRP的抗乳腺癌活性进行初步筛选,采用MTT法检测APs和APRP对小鼠乳腺癌细胞4T1和人乳腺癌细胞HCC 1937增殖的影响。结果表明APs与APRP对两种乳腺癌细胞增殖均有明显的抑制作用,但APs的作用效果明显优于APRP,因此选择用APs为实验材料用于后续研究。（2）九香虫多糖对乳腺癌细胞增殖的影响为明确APs对乳腺癌细胞增殖的影响,采用MTT法和CCK-8法检测细胞增殖率。结果显示APs能够显著抑制小鼠乳腺癌细胞4T1、人乳腺癌细胞MDA-MB-453、MCF-7增殖（P＜0.01）,且呈时间、剂量依赖性。（3）九香虫多糖对乳腺癌细胞生长的影响为明确APs对乳腺癌细胞生长的影响,通过形态学观察APs作用24、48 h后上述三种乳腺癌细胞形态的变化。结果表明APs能够引起乳腺癌细胞皱缩、细胞间隙变大、出现漂浮细胞,且随着其浓度的增加和时间的增长,细胞皱缩的程度更严重,漂浮细胞的数量增多。（4）九香虫多糖对乳腺癌细胞迁移的影响为明确APs对乳腺癌细胞迁移的影响,采用细胞划痕实验检测APs作用12、24、48 h后三种乳腺癌细胞迁移率的变化。结果显示APs能够显著抑制细胞迁移,且呈剂量依赖性。（5）九香虫多糖对乳腺癌细胞凋亡的影响为明确APs对乳腺癌细胞凋亡的影响,采用Hoechst 33258染色检测APs作用于三种乳腺癌细胞12、24 h后的细胞凋亡率。结果显示APs能够促进三种乳腺癌细胞凋亡,且随APs浓度的增加和作用时间的延长,凋亡细胞数量明显增加,相对荧光强度显著增强。（6）九香虫多糖对乳腺癌细胞周期的影响为明确APs对乳腺癌细胞周期的影响,采用流式细胞术检测APs作用于三种乳腺癌细胞24 h后,乳腺癌细胞在各细胞周期的分布。结果显示APs处理后,4T1细胞G1期细胞数量显著减少（P＜0.01）,S期细胞数量显著增多（P＜0.001）,MDA-MB-453和MCF-7细胞G1期细胞数量显著增多（P＜0.05）,G2期和S期细胞数量减少。说明九香虫多糖将4T1细胞周期阻滞于S期,细胞无法顺利进入有丝分裂的准备阶段,使之无法正常分裂,进而抑制了乳腺癌细胞的增殖,MDA-MB-453和MCF-7细胞周期阻滞于G1期,使进入S期开始DNA复制的细胞数量受到控制,导致细胞不能够继续增殖。3、九香虫多糖对乳腺癌相关通路关键基因表达的影响（1）九香虫多糖对关键基因表达的影响为明确APs对乳腺癌细胞中增殖（C-MYC）、迁移（MMP-2、MMP-9）、凋亡（Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2）、周期（CDK 1、CDK 2、CDK 4、cyclin A1、cyclin B1）相关基因表达的影响,采用实时荧光定量PCR检测APs作用24 h,两种人乳腺癌细胞MDA-MB-453和MCF-7中相关基因的表达量。实验结果表明,APs作用于两种乳腺癌细胞24 h,C-MYC、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、CDK 1、CDK 2、CDK 4、cyclin A1、cyclin B1表达下调,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax表达上调,说明九香虫多糖可能通过上调促凋亡基因的表达,下调抑凋亡、增殖、迁移、细胞周期相关基因的表达来抑制乳腺癌细胞的发生和迁移。（2）九香虫多糖对关键蛋白表达的影响为明确九香虫多糖对乳腺癌细胞中凋亡（Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2）、迁移（MMP-2、MMP-9）相关蛋白表达的影响,通过蛋白免疫印迹（Western blot）检测九香虫多糖作用24 h人乳腺癌细胞中相关蛋白的表达量。实验结果表明,九香虫多糖作用上述两种乳腺癌细胞24 h,促凋亡蛋白（Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax）表达量上调,抑凋亡蛋白（Bcl-2）表达量下调,基因金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）表达量下调,进一步说明九香虫多糖可能通过抑制细胞迁移、促进细胞凋亡来实现抑制乳腺癌细胞发生发展。综上,采用水提醇沉法提取九香虫多糖的最优条件为液料比40 m L/g、提取温度90℃、提取时间3 h、提取次数3次,在此条件下九香虫多糖提取率为5.067±0.024%。九香虫多糖具有良好的抗乳腺癌活性,能够抑制乳腺癌细胞增殖、迁移,导致细胞皱缩,促进细胞凋亡,阻滞细胞周期;其作用机理主要通过上调乳腺癌细胞中促凋亡基因表达,下调抑凋亡基因和增殖、迁移、周期相关基因表达;上调促凋亡蛋白表达,下调抑凋亡蛋白和细胞迁移相关蛋白表达实现。