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第一部分:人肝癌组织ɑ―L-岩藻糖苷酶的提取和鉴定【摘要】目的:提取人肝癌组织的ɑ-L-岩藻糖苷酶(ɑ-L-fucosidase,AFU)经纯化和鉴定后,为制备特异性多克隆抗体提供纯化的抗原。方法:运用超滤和离子交换层析等方法提取、纯化人肝癌组织的AFU,并经SDS-PAGE检测蛋白纯度及相对分子质量。根据荧光底物4-甲基微型酮-α-L-岩藻糖苷(4-methylumbelliferyl-α-L-fucopyranoside,4-MU-fucoside)和纯化的蛋白在特定条件下反应生成产物4-甲基微型酮(4-methylumbelliferone,4-MU)的量来检测酶活性。检测蛋白浓度用Bradford方法。结果:提纯并纯化的AFU经SDS-PAGE鉴定有一个亚单位Mr 55000。经过一系列纯化步骤后,肝癌组织的AFU可得到74倍纯化,15%收率。结论:肝癌组织的AFU可通过离子交换层析法提取和纯化并可用于制备抗体。第二部分:抗人肝癌组织α-L-岩藻糖苷酶抗体的制备及运用【摘要】目的:制备和纯化肝癌特异性α-L-岩藻糖苷酶多克隆抗体及初步研究其在肝癌诊断中的临床作用。方法:用自行提取和纯化的人肝癌组织α-L-岩藻糖苷酶免疫家兔,以间接ELISA检测抗血清效价和工作浓度。抗血清经阴离子交换法纯化后采用Western blotting鉴定纯化的α-L-岩藻糖苷酶。用免疫组化方法定位α-L-岩藻糖苷酶在肝癌组织中的分布情况。结果:抗血清的效价和工作浓度经间接ELISA检测分别为1:32 000, 1:4 000。抗血清经过饱和硫酸铵沉淀,阴离子交换树脂DEAE-52纯化后可在第115收集管前后出现一明显洗脱峰。Western blot显示纯化的多克隆抗体可特异性地识别Mr 55kD的α-L-岩藻糖苷酶。免疫组化表明α-L-岩藻糖苷酶多表达于肝癌组织不表达于癌旁组织。结论:本实验制备的抗人肝癌组织α-L-岩藻糖苷酶多克隆抗体可用于检测肝癌组织和血清中α-L-岩藻糖苷酶的表达水平。