论文部分内容阅读
研究背景：非小细胞肺癌(NSCLC)占原发性肺癌80%以上,超过60%的患者为中晚期,常失去手术机会,化疗是Ⅲb-Ⅳ期NSCLC的主要治疗手段。顺铂(DDP)仍然是NSCLC一线化疗方案中的重要组成药物,但其获得性耐药制约了其疗效的发挥。microRNA (miRNA)是一类非编码小RNA分子,通常在转录后水平调控基因表达。成熟miRNA通过与mRNA完全或不完全配对,降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译。miRNA作为肿瘤抑制基因或癌基因参与多种肿瘤发生发展。随着miRNA与肿瘤之间的关系逐渐被揭示,有证据表明,肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性受miRNA的调控。miR-224在多种人类恶性肿瘤中高表达,作为癌基因参与肿瘤的增殖、凋亡及转移等生物学过程；亦有研究提示miR-224与结肠癌耐甲氨蝶呤有关。然而目前尚未有miR-224影响NSCLC化疗敏感性的相关报道。研究目的：探讨miR-224在人NSCLC细胞中的表达及对DDP敏感性的影响,并探讨其作用机制。研究方法：(1)microRNA芯片检测人NSCLC耐顺铂细胞株A549/DDP与敏感亲代细胞株A549中microRNA表达谱,并利用荧光实时定量PCR (qRT-PCR)进行验证。(2)人工合成miR-224-inhibitor,通过LipofectamineTM2000瞬时转染入A549/DDP细胞并检测其转染效率。MTT实验检测DDP对耐顺铂细胞株A549/DDP、敏感亲代细胞株A549及转染后A549/DDP细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration, IC50)。流式细胞术分析转染后A549/DDP细胞联合DDP处理的细胞凋亡与细胞周期分布。(3)生物信息学分析miR-224可能作用的靶基因,发现miR-224序列上存在p21WAFl/CIP13’UTR结合位点。qRT-PCR与Western blot检测p21WAF1/CIP1在耐顺铂细胞株A549/DDP、敏感亲代细胞株A549、A549/DDP/miR-224-inhibitor、 A549/DDP/miR-NC中的mRNA与蛋白表达水平。构建含p21WAF1/CIP13’URT荧光素酶报告载体并通过双重荧光素酶报告实验分析其活性。(4)构建pcDNA3.1/p21WAF1/CIP1过表达载体转染入耐顺铂细胞株A549/DDP并通过qRT-PCR与Western blot检测其表达。MTT实验检测DDP对转染后A549/DDP细胞的IC50。流式细胞术分析转染后A549/DDP细胞联合DDP处理的细胞凋亡与细胞周期分布。(5)活体实验检测抑制miR-224表达的A549/DDP细胞对DDP敏感性；qRT-PCR与免疫组化检测miR-224与p21WAF1/CIP1在活体水平的表达相关性。(6)Western blot检测P53通路及下游靶分子Bcl-2, Bax在A549/DDP/miR-224-inhibitor+/-DDP、A549/DDP/miR-NC+/-DDP的表达情况。研究结果：(1)相较于敏感亲代细胞株A549, miR-224在耐顺铂细胞株A549/DDP显著高表达；(2)抑制miR-224表达的A549/DDP细胞对DDP的敏感性增强：DDP对A549/DDP/miR-224-inhibitor、A549/DDP/miR-NC的IC50分别为16.57±1.62μg/ml、29.47±2.15相较于对照组,转染miR-224inhibitor的A549/DDP细胞联合DDP处理后细胞凋亡增加、细胞周期阻滞于G1期增多；(3)体外水平p21WAF1/CIP1与miR-224表达存在负相关：相较于敏感亲代细胞株A549,p21WAF1/CIP1在耐顺铂细胞株A549/DDP明显低表达；抑制miR-224在A549/DDP细胞中的表达后,p21WAF1/CIP1表达明显升高。双重荧光素酶报告实验证实p21WAF1/CIP1为miR-224直接靶基因；(4)过表达p21WAF1/CIP1可模拟抑制miR-224表达生物学效应；(5)活体实验证实抑制miR-224表达的A549/DDP细胞对DDP敏感性增强；活体水平miR-224与p21WAF1/CIP1表达呈负相关；(6)在给予DDP处理的A549/DDP细胞抑制miR-224表达可激活P53,诱导下游靶分子Bax表达上调、Bcl-2表达下调。结论：体内外实验证实：抑制miR-224表达可逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞对DDP的耐药性,这一作用可能通过靶作用p21WAF1/CIP1以及调控P53通路来实现的。