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乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的持续感染与慢性肝病的发生发展密切相关。乙肝病毒X开放读码框编码的X蛋白（HBx）在肝癌的发生发展中具有重要的作用，但其致癌的分子机制目前尚不十分清楚。为了进一步阐明HBx与肝癌发病的关系，我们检测了慢性肝病患者血清中乙肝病毒X抗原（HBxAg）和抗HBx抗体（anti-HBx）；应用PCR技术对慢性肝病患者血清中乙肝病毒X基因进行检测，发现了新的HBV x基因突变体，在此基础上对新的HBV X基因突变体的功能进行了研究。主要研究内容如下：
第一部分，兔抗人HBx蛋白多克隆抗体的制备
为了阐明慢性肝病患者血清中HBxAg和anti-HBx的临床意义，制备了兔抗人HBx蛋白多克隆抗体。实验中，首先应用PCR技术，获得HBx基因片断，然后将其克隆至pET-30a原核表达载体中，将其命名为pET-30a-X。将pET-30a-X质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，大量表达His-HBx融合蛋白；利用Ni-NTA磁珠对His-HBx融合蛋白进行纯化；纯化后将重组蛋白免疫家兔，制备兔抗HBx多克隆抗体，并对该抗体进行纯化。
第二部分，慢性肝病患者血清中HBxAg和anti-HBx的测定及其临床意义
为了阐明慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者血清中HBxAg和anti-HBx的临床意义，我们应用纯化的兔抗HBx多克隆抗体和重组蛋白，建立酶联免疫吸附实验（ELISA）技术，分别对173例慢性乙型肝炎（CHB）、106例肝硬化（LC）和61例肝癌（HCC）患者及213例正常人血清中的HBxAg和anti-HBx进行了检测。结果显示，HBxAg/anti-HBx在CHB、LC和HCC患者血清中的阳性率分别为8.7％/10.4％、17.9％/14.6％和9.8％/34.4％。统计学分析结果显示，与CHB组相比，LC或HCC患者血清中anti-HBx的阳性率较高（P<0.01）。结合临床病历中记录的其他HBV血清学指标检测结果，进行统计分析，发现在血清anti-HBs阳性病例中，anti-HBx的阳性检出率为5.2％（1/19）；而在HBsAg、HBeAg和anti-HBc三项同时为阳性的病例中，anti-HBx的阳性检出率为28.9％（39/135），二者相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。对照组213名正常人血清中HBxAg和anti-HBx均为阴性。本研究结果提示，血清中anti-HBx并非一个保护性抗体，而是HBV感染和复制的标志，是从CHB向LC或HCC发展的重要标志之一。
第三部分，新的乙肝病毒x基因突变体的发现
HBV感染后患者血清中病毒DNA发生突变与HBV的致病作用密切相关。实验中，我们应用PCR方法对42例CHB、94例LC和52例HCC患者血清中HBx基因进行扩增，对PCR产物进行序列测定，检测HBx基因的突变情况。结果显示，在1例CHB和2例LC患者血清中检测出一个未见报道的新的HBx基因突变位点。3例位点均在HBx基因的第382-401个碱基发生了缺失突变，导致新的终止密码子TAG产生，致使X蛋白从第127个氨基酸起羧基末端表达缺失。
第四部分：突变型HBx蛋白功能变化的研究
为了进一步详细阐明该HBx基因突变体发生的分子病毒学意义，我们将来源于血清中发生突变的HBx基因构建于真核表达载体pCDNA3中，命名为pCDNA3-X-Sera。此外，人为将野生型HBx基因的C末端编码27个氨基酸的81个碱基进行缺失突变，将其克隆在真核表达载体pCDNA3中，命名为pCDNA3-X△127。为进一步研究该突变体的功能变化奠定基础。从以下几个方面进行了研究：
第一，诱导细胞凋亡的作用：将pCDNA3-X-Sera、pCDNA3-X△127质粒和克隆有野生型HBx基因的真核表达载体（pCMV-X）分别进行瞬时基因转染，导入人正常人L-O2肝细胞系中，通过流式细胞术分析。结果显示，野生型HBx基因具有促细胞凋亡的作用，而两个突变型HBx基因的上述功能消失。
第二，介导细胞转化的作用：实验中，应用基因转染技术将pCMV-X质粒和克隆有3’端缺失突变型HBx基因的pCDNA3-X-Sera、pCDNA3-X△127质粒分别导入培养的人正常肝细胞系L-O2中，经G-418筛选，获得了稳定表达HBx蛋白的肝细胞系，分别命名为L-O2-X、L-O2-X-Sera和L-O2-X△127。然后，对L-O2-X、L-O2-X-Sera和L-O2-X△127细胞进行了生物学特性鉴定，从细胞形态、染色体核型、细胞动力学、细胞周期、克隆形成率和癌蛋白表达等方面进行检测。结果显示，与L-O2-X细胞相比，L-O2-X-Sera和L-O2-X△127细胞在染色体核型分析方面，表现出更为明显的染色体丢失或异倍体；在细胞增殖方面，增殖能力明显增强；在克隆形成率方面，具有较高的能力：c-Myc、PCNA和cyclinD1的表达水平明显增加。初步结果提示，新发现的HBx基因突变体具有更强的细胞转化能力。
综上所述，本研究发现血清中anti-HBx是慢性肝病患者从CHB向LC和（或）HCC发展的重要血清学标志之一；从慢性肝病患者血清中发现了新的HBx基因突变体，导致HBx蛋白羧基末端的27个氨基酸表达缺失；与野生型HBx基因相比，该HBx基因突变体的促细胞凋亡功能消失，但其细胞转化能力明显增强，对发挥其致癌作用具有重要意义。上述研究为揭示HBx基因和HBx蛋白致癌的分子机制提供了新的重要的实验依据，对肝癌的早期诊断、预防和治疗具有重要的理论意义和实际应用价值。