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目的:应用CRISPR/Cas9系统构建TRIM11基因稳定、永久性敲低的人结肠癌HT29细胞,探讨TRIM11基因敲低对HT29细胞生长及5-FU药物敏感性的影响,为临床结肠癌治疗寻找新靶点。方法:1.收集经组织学或细胞学证实的结肠癌患者术后新鲜癌组织及癌旁正常组织标本,采用qRT-PCR检测TRIM11在结肠癌组织与癌旁正常组织中的表达差异。2.设计并合成靶向TRIM11基因的sgRNA,连接至LentiCRISPRv2载体,经测序验证后将重组质粒导入病毒包装细胞293T中,收集病毒上清转染结肠癌细胞HT29,应用Western Blot测定转染后HT29细胞中TRIM11蛋白表达量,获得TRIM11敲低的HT29-KD细胞株。3.用CCK-8法检测HT29-KD细胞及HT29细胞5天增殖变化,分析TRIM11低表达对HT29细胞增殖的影响。4.应用克隆形成实验比较HT29-KD细胞及HT29细胞克隆形成能力差异,分析TRIM11敲低对肠癌细胞HT29克隆形成能力的影响。5.5-FU诱导HT29-KD细胞及HT29细胞凋亡,24h后行流式细胞术检测细胞凋亡情况,分析TRIM11低表达对化疗药物5-FU诱导HT29细胞凋亡的影响。结果:1.根据入排标准,收集到术后新鲜癌组织及对应的癌旁正常组织标本各23例。qRT-PCR结果显示:在获得的23对组织中,有20对组织的肿瘤组织TRIM11表达明显高于对应的癌旁正常组织,经配对t检验P<0.05(n>3),差异有统计学意义。2.成功获得3种LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒,测序结果显示sgRNA插入质粒DNA的位置、方向及序列与预期相符;将经3种慢病毒(含LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒)转染的HT29细胞行Western Blot鉴定,发现3种细胞出现不同程度的TRIM11蛋白表达下调,其中敲除片段2的细胞几乎不表达TRIM11蛋白。3.CCK-8增殖检测结果显示:细胞培养至第4、5天时HT29细胞增殖率分别为(891±120)%和(1999±100)%,HT29-KD细胞增殖率分别为(559±58)%和(1200±68)%,经配对t检验P<0.01(n>3),差异有统计学意义,说明敲低TRIM11抑制HT29细胞增殖。4.克隆形成实验结果显示:与HT29细胞克隆形成率为100%的对照组相比,HT29-KD细胞克隆形成率为(25±12.51)%,经两样本t检验P<0.05(n>3),差异有统计学意义,表明敲低TRIM11抑制HT29细胞克隆形成。5.流式细胞术结果显示:5-FU诱导细胞凋亡后,HT29-KD细胞早期凋亡率为(5.43±0.12)%,高于对照组HT29细胞早期凋亡率(4.17±0.31)%,经两样本t检验P﹤0.05(n>3),差异有统计学意义,表明敲低TRIM11促进化疗药物5-FU诱导HT29细胞凋亡。结论:1.成功构建TRIM11基因靶向敲除的LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒,获得TRIM11稳定低表达的HT29-KD细胞株。2.敲低TRIM11基因降低HT29细胞增殖,抑制细胞体外克隆形成,并促进5-FU对该细胞的凋亡诱导。