【摘 要】
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Pax5是特异表达于B细胞的核转录因子,在早期B细胞定向分化发育过程中发挥重要的调控作用。在本研究中,从人B淋巴细胞性白血病细胞（Raji细胞）中提取总RNA,应用RT-PCR获得cDNA,经PCR扩增出1176bp的目的片段。将此片段连接至pMD-19T载体,进行PCR、双酶切鉴定及测序,结果显示目的片段序列正确,无突变。进而将该Pax5目的片段连接至pET28a载体,构建重组表达载体（pET2
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Pax5是特异表达于B细胞的核转录因子,在早期B细胞定向分化发育过程中发挥重要的调控作用。在本研究中,从人B淋巴细胞性白血病细胞（Raji细胞）中提取总RNA,应用RT-PCR获得cDNA,经PCR扩增出1176bp的目的片段。将此片段连接至pMD-19T载体,进行PCR、双酶切鉴定及测序,结果显示目的片段序列正确,无突变。进而将该Pax5目的片段连接至pET28a载体,构建重组表达载体（pET28a-Pax5）,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经0.5mmol/L IPTG诱导可表达相对分子量为42000的Pax5蛋白,然后利用镍柱子亲和层析对Pax5蛋白进行纯化。用鼠抗Pax5单克隆抗体的Western blot的实验结果表明纯化的蛋白是Pax5蛋白。用纯化Pax5蛋白免疫兔子,并制备兔抗Pax5多克隆抗体,ELISA方法检测显示抗血清的效价为1：25600,证实了原核表达的Pax5蛋白具有很好的免疫原性。Western blot和免疫荧光检测结果表明,兔抗Pax5多克隆抗体能够特异性识别Raji细胞的内源性Pax5蛋白。Pax5原核表达和多克隆抗体的制备为后续研究提供了重要的实验材料。另外,我们用Invitrogen软件设计了Pax5基因的两个siRNA片段,并将其转染70z/3细胞24h后用PCR和Western blot检测RNAi效果,筛选出最佳干扰片段,以此设计出可表达Pax5siRNA短发夹的Oligo DNA（带有BamH Ⅰ与Cla Ⅰ酶切位点）,并连接至pSINsi-hU6逆转录病毒载体,经PCR鉴定显示成功地构建了pSINsi-hU6/Pax5-siRNA载体,按照TaKaRa包装试剂盒说明操作,用293T细胞对逆转录病毒进行包装,收集病毒液,将其感染70z/3细胞,用含有G418的培养基进行2周的筛选,结果显示成功建立Pax5基因沉默的70z/3细胞模型,为Pax5在早期B细胞分化发育中生物学功能研究奠定实验基础。
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