近年来，随着越来越多的关于多不饱和脂肪酸(PUFAs)和脂肪酸脱氢酶在食品、医药、保健品等领域的重要作用的揭示，引起了国内外学者的广泛关注。由于传统来源的局限性及膜蛋白的难获得性，因此人们将更多的目光投向两个方面，1寻找新的生产PUFAs的替代来源。2提高膜蛋白的表达量以求得到膜整合脱氢酶的晶体结构。接合菌等丝状真菌和产多不饱和脂肪酸的甲醇酵母被认为是生产多不饱和脂肪酸的重要的潜在的来源。与此同时，甲醇酵母作为生产药用蛋白的受体菌，在合成脂肪酸脱氢酶蛋白方面也有其独特的优点。但要达到此目的，就必须要了解和掌握其多不饱和脂肪酸的生物合成机制，才能获得产量更高和质量更好的产品。从少根根霉和巴斯德毕赤酵母中克隆与多不饱和脂肪酸生物合成相关的基因，将有助于阐明其体内多不饱和脂肪酸的生物合成途径。在此基础之上的对少根根霉和巴斯德毕赤酵母PUFAs生物合成途径的全面综合研究和改造，将有助于利用现代生物工程技术将它们构建成为PUFAs和脂肪酸脱氢酶高产量性状的基因工程菌株，为大规模生产PUFAs和分离纯化膜整合脂肪酸脱氢酶蛋白建立基础。 参照丝状真菌和酵母来源的△12、△9-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR，从少根根霉基因组中获得一个长度为730bp的△12-脂肪酸脱氢酶基因的部分DNA片段，命名为RAD12Ⅰ/Ⅲ。从巴斯德毕赤酵母cDNA中分别获得长度为681bp的△12-脂肪酸脱氢酶基因的部分序列并命名为PPD12Ⅰ/Ⅲ和长度为741bp的△9-脂肪酸脱氢酶基因的部分序列并命名为PPD9Ⅱ/H。序列分析发现，RAD12Ⅰ/Ⅲ在组氨酸Ⅰ区和Ⅲ区之间含有两个内含子，长度分别为50bp和47bp，去除内含子后的序列编码228个氨基酸，PPD12Ⅰ/Ⅲ编码227个氨基酸，PPD9Ⅱ/H编码247个氨基酸。氨基酸序列的相似性搜索表明，所扩增片段分别为新的潜在的△12和△9-脂肪酸脱氢酶基因的部分DNA序列。根据获得的部分序列设计基因特异性引物，通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得三个cDNA的3’和5’两端序列，从而获得三个全长分别为1315bp(命名为RAD12FULL)、1394bp(命名为PPD12FULL)和1689bp(命名为PPD9FULL)的cDNA序列。序列分析结果表明，这三个全长cDNA序列分别包含有三个开放阅读框架。开放阅读框架的命名和长度分别为RAD121170bp、PPD121263bp、PPD91194bp。所编码蛋白质的分子量分别为44.7kDa、50.05kDa和44.9kDa。推测的氨基酸序列与报道的△12、△9-脂肪酸脱氢酶一样，具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个保守的组氨酸富集区和2个长的疏水结构，△9-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列的C末端还具有细胞色素b5区，表明这些序列为新的潜在的编码△12、△9-脂肪酸脱氢酶的基因。将所有已报道的功能已经确定的△12和△9-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列分别进行了系统进化分析。结果发现，在△12-脂肪酸脱氢酶当中原核和高等植物的叶绿体的△12-脂肪酸脱氢酶构成一个单系群位于分支的底部，第二个单系群包括真菌和高等植物的微粒体△12-脂肪酸脱氢酶。可以推测原核类型的△12-脂肪酸脱氢酶是所有△12-脂肪酸脱氢酶的共同祖先。而对膜整合△9-脂肪酸脱氢酶的系统进化分析表明，△9-脂肪酸脱.氢酶可以分为原核、高等植物、真菌、无脊椎动物和脊椎动物几个类型，真核类型的△9-脂肪酸脱氢酶在后来的进化中形成更具选择优势的细胞色素b5融合蛋白。 为了验证所获得序列的功能，把潜在的编码序列RAD12和PPD12亚克隆到表达载体pYES2.0，构建重组表达质粒pYRAD12和pYPPD12，并转化酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-MS)分析表明，这两个序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白都具有△12-脂肪酸脱氢酶活性，能催化底物——油酸转化成亚油酸(LA)，LA占酵母总脂肪酸的含量分别为4.85％和30％。对少根根霉和巴斯德毕赤酵母△12-脂肪酸脱氢酶基因表达调控的分析结果表明，低温能够增加△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达水平。而在培养基中加入外源的不饱和脂肪酸则会降低基因的转录水平。 为深入研究脂肪酸脱氢酶的结构与功能的关系，对已有大引物介导的定点突变方法进行了改进，通过单边PCR、大引物、降低模板量和用DpnⅠ处理等方法相结合提高了定点突变的效率，降低了突变的成本。利用此方法对深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的突变分析表明，靠近组氨酸富集区Ⅰ区的跨膜区微小变化也会影响脂肪酸脱氢酶的活性。