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甘蔗是最重要的糖料作物,占我国食糖产量的90%以上,同时它也是南方地区生产燃料乙醇的最佳可再生能源作物。甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaic virus,ScMV)引起的甘蔗花叶病是我国和世界甘蔗生产中最主要的病害之一,造成产量下降、品质变劣和品种种性退化,培育和栽培抗病品种是最有效的措施,其次是利用脱毒健康种苗,与带毒供体相比,增产幅度可达30%以上。尽管传统有性杂交仍是目前培育甘蔗抗病品种最普遍采用也是最有成效的方法,但是,利用基因工程技术改良甘蔗品种已成为有效的高新技术途径。 在国家“十五”863项目(2002AA241031)和农业部948项目(2003—Q06)项目的资助下,农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室开展了甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白基因(ScMV-ECP)转化甘蔗研究,并已获得一批获准进行中间试验的转基因甘蔗,有关转基因甘蔗特异蛋白的时空表达情况和表达量研究均需要高度特异的抗体。另一方面,脱毒健康种苗的生产和应用也需要快速、灵敏的检测技术作为支撑,抗体免疫技术无疑可满足该技术的要求。基于此,本研究以ScMV-ECP基因为外源目的基因,通过构建原核表达载体转化原核生物EscherichiacoliBL21(DE3),获得该基因的特异表达蛋白,再以其作为免疫原制备多克隆抗体。主要结果如下: (1) 根掘ScMV-ECP基因的序列和原核表达载体的酶切位点,设计两条分别带有BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的引物,以带有甘蔗花叶病毒E株系CP基因的质粒pNUSCP为模板,利用PCR方法扩增获得一个长度与ScMV-ECP基因完整片段相当的特异性片段。回收并纯化该片段,并连接到克隆载体pMD18-T Simple Vector上,转化E.coli菌株DH5a,利用氨苄青霉素筛选抗性菌落,PCR和酶切鉴定拟转化子。 (2) 采用内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ同时消化转化子pMD18-T-CP质粒