干扰素基因刺激分子(STING)是近年来新发现的天然免疫信号通路中的关键接头蛋白,在机体感受胞质DNA和免疫防御方面起到重要的信号传递作用。STING可以参与多种病原体dsDNA或RNA刺激引起的机体固有免疫反应,招募TBK1并激活下游IRF3从而诱导I型干扰素的产生,调控机体的抗感染免疫应答。羊口疮病毒(ORFV)是重要的人兽共患病病原体,侵害对象包括绵羊和山羊、多种野生动物和人类。在我国由ORFV引起的羊口疮已经成为制约养羊业发展的最重要疾病之一,临床预防和治疗困难重重。本研究率先获得了山羊抗病毒基因STING的序列并制备了兔抗山羊多克隆抗体,在此基础上,对ORFV感染过程中STING的分子作用机制进行了系统研究,为探索STING在山羊疾病防控中的作用提供了基础数据。详细研究内容如下:海南黑山羊STING基因的克隆及序列分析运用RT-PCR方法扩增了海南黑山羊STING基因并提交到GenBank,获得Accession No.:KR060015。对序列分析发现STIN G基因编码378个氨基酸。对不同物种STING序列和氨基酸进行同源性分析,发现海南黑山羊STING基因与牛的同源性最高为97.4%,与斑马鱼的同源性最低为47.1%;构建系统发育树也显示该基因物种内的同源性高,种间同源性低。STING蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备运用pET-30a(+)质粒构建p ET-30a(+)-STING去跨膜区的重组质粒,并在大肠杆菌中成功表达出约28 KDa的重组蛋白;运用此纯化后重组的蛋白免疫新西兰大白兔制备兔抗STING多克隆抗体;经过Western blot和ELISA证实,抗体能保持着良好的特异性和抗原活性。STING蛋白的特异性表达和组织学分布的研究运用Real Time PCR研究海南黑山羊不同组织中的STING的mRNA表达水平,发现在肠系膜淋巴结中表达量最高,而在心、脾和大脑的表达量高于肺、肾和肝脏。运用免疫组化探索STING蛋白在不同细胞中的表达,发现该蛋白特异表达于阳性细胞胞浆中。在心肌细胞胞浆、肝细胞胞浆、脾小结生发中心和外周淋巴细胞、支气管上皮细胞和肺泡部分上皮细胞、肠系膜淋巴小结生发中心和部分外周淋巴细胞为强阳性表达,在肾小管上皮细胞和大脑皮层为弱阳性表达。过表达和干扰STING蛋白重组质粒的构建及表达选用pEGFP-N1和pSuper.Retro.Neo+GFP载体构建STING过表达质粒pEGFP-N1-STING和STING干扰质粒shRNA-STING。通过细胞转染、绿色荧光观察和Western-blot验证此重组质粒都能在细胞中表达。其中STING与GFP的融合蛋白约69 KDa可以被检测到,而STING蛋白的干扰效率高达70%左右,成功建立STING蛋白的专性表达和抑制表达细胞系。STING在ORFV感染OFTu细胞中的抗病毒作用研究将ORFV感染正常、过表达和干扰STING蛋白的细胞后,检测不同时间段的相关信号通路蛋白、细胞因子的表达水平和病毒的生长曲线。发现病毒感染正常细胞后,激活机体STING在内的多种受体(如DDX41、RNA Poly III、RIG-1、cGAS、TBK1和IRF3)的抗病毒反应;过表达STING后,细胞的抗病毒能力显著增强;干扰STING后细胞抵抗病毒能力下降了。分析病毒生长曲线发现,STING能够有效地抑制病毒的增值,而干扰STING有利于病毒的增值。说明STING蛋白在抗ORFV增殖和感染过程中发挥了重要的作用。