家蚕(Bombyx mori)是一种具有重要经济价值的泌丝昆虫,属于变温动物,最适生长温度为25℃。在养蚕业中,低温引起家蚕生长缓慢,高温导致蚕病的发生,降低蚕茧产量及茧丝质量。本实验室前期研究发现,Bmhsp19.9在高温和低温处理后的家蚕中都被诱导上调表达,推测其可能有助于家蚕对极端温度的耐受性。本研究制备了增量表达Bmhsp19.9的转基因家蚕并对其极端温度耐受能力进行了检测,进而评估了转基因家蚕的安全性,包括基因漂移风险和毒理学试验。主要获得以下的研究结果:1.增量表达Bmhsp19.9提高转基因家蚕对极端温度的耐受性温度胁迫会破坏生物细胞中的蛋白质稳态,小热激蛋白(s Hsps)在维持蛋白质稳态和保护细胞免受各种不利条件的影响中发挥着至关重要的作用。本研究首先通过RT-PCR和q PCR分析了Bmhsp19.9的表达模式;然后克隆了Bmhsp19.9的启动子hsp19.9P1和hsp19.9P2,q PCR和western blot结果显示,序列较长的启动子hsp19.9P1的活性比hsp19.9P2更高。增量表达Bmhsp19.9保护了Bm E细胞在高温胁迫下的活力;进而构建了由hsp19.9P1介导的Bmhsp19.9转基因增量表达载体pb-H19.9,通过显微注射P50家蚕胚胎获得了两个转基因品系H19.9A和H19.9B。q PCR和western blot显示转基因家蚕中Bmhsp19.9的表达量高于对照;与非转基因对照P50相比,在35℃高温处理49 h后,转基因品系的死亡率降低40%左右;当P50和H19.9A在13℃条件下饲养时,H19.9A的生长速率更快,其存活率和存活幼虫体重显著高于P50。这些结果表明,增量表达Bmhsp19.9提高了转基因家蚕对极端温度的耐受性。2.评估转基因DNA从家蚕转移到肉鸡的潜在可能性为了评估转基因DNA从家蚕转移到其他生物的潜在可能性,将100只孵化1天的雄性肉鸡平均分为4个组(T1-T4)。T1-T3组分别饲喂插入了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)DNA的转基因家蚕P3+5UI、插入了超氧化物歧化酶(SOR)DNA的转基因家蚕A4SOR和正常家蚕DZ,每只鸡每天饲喂一头家蚕幼虫,连续饲喂3周;T4为正常饮食对照。在第22日龄时,从每个处理组中随机挑选二十只鸡处死,收集血液进行血清生化检查,结果表明T4和T1-T3之间的血清参数没有明显差异。提取十二指肠、空肠、回肠、肝脏、肾脏和空肠消化物的DNA,利用EGFP、SOR、家蚕看家基因TIF-4A和鸡卵清蛋白基因OV特异引物进行PCR扩增,未在鸡的消化物和组织中检测到转基因DNA或家蚕TIF-4A。进一步增加转基因家蚕的添食数量和频率,在肉鸡中也观察到了相同的结果。这些结果表明来自家蚕的转基因DNA在鸡的消化道中被降解且没有转移到其他组织中。3.转基因家蚕的28天经口毒性试验将Sprague-Dawley大鼠分为4组(T1-T4)。T1-T3组分别饲喂耐高温转基因家蚕H19.9A、耐高温转基因家蚕A4SOR以及非转基因家蚕P50。以3.0 g/kg/day的剂量给每只大鼠经口饲喂干蚕蛹,连续饲喂28天。T4为正常饮食对照组。每周对各组大鼠进行体重的称量以及饲料消耗量的检测,在28天后收集血液进行血液生理和血清生化的检测,并解剖大鼠的主要器官进行称重,计算脏器指数;同时,对大鼠的主要脏器进行组织切片观察。结果显示,在雌鼠的各组之间以及雄鼠的各组之间每周平均体重无显著差异。雄鼠的各组之间每周饲料消耗量无显著差异;雌鼠中,在第二周T1显著低于T4,但与T3无差异,因此差异与饲喂转基因蚕蛹处理无关。在所测的16项大鼠血液指标中:雌鼠的MPV、HGB、HCT在各组之间有差异,雄鼠的HCT在各组之间有差异;在所测的12项大鼠血清生化指标中:雌鼠的ALT、AST、TRIG在各组之间有差异,雄鼠的CHOL、P在各组之间有差异,但由于在转基因蚕蛹组中这些指标没有同时与两个对照组都存在差异,这些差异均与饲喂转基因蚕蛹处理无关。在脏器指数结果中,雌鼠的肝脏、肾上腺、子宫在各组之间有差异,雄鼠的肾上腺、睾丸在各组之间有差异,但由于在转基因蚕蛹组中这些指标没有同时与两个对照组都存在差异,这些差异与饲喂转基因蚕蛹处理无关。组织病理学检查结果中,各组大鼠的脏器组织结构未见明显差异,未发现由转基因蚕蛹处理所导致的大鼠脏器组织病理学改变。在28天经口毒性试验中,没有发现转基因蚕蛹对大鼠生长发育不利的影响,表明转基因家蚕在毒理学上与正常家蚕没有区别。