菜心醛酮还原酶BclAKR4C10基因的克隆、亚细胞定位和VIGS载体构建

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炭疽病是菜心(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee)生产上重要的病害之一,病原菌的侵染会造成叶片出现“麻点”,影响菜心外观品质,降低其经济价值。经过多年的调查与检测,导致菜心炭疽病发生的主要病原菌为希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsiamum)。植物醛酮还原酶超家族(Aldo-keto reductase super family,AKRs)基因是植物抗逆途径的一类重要基因。本研究采用RT-PCR方法,从菜心叶片中克隆得到一个菜心醛酮还原酶基因BclAKR4C10,分析了BclAKR4C10基因序列和生物学特性,开展了BclAKR4C10基因的亚细胞定位研究和炭疽病菌侵染菜心0 h、6 h、12 h、24 h、48 h时的荧光定量表达分析,进行了菜心VIGS载体体系的构建,初步阐明了BclAKR4C10基因与菜心抗炭疽病的分子基础,为十字花科蔬菜炭疽病的科学防治提供新的生物学途径。主要研究结果如下:(1)菜心BclAKR4C10基因:开放阅读框948 bp,共编码315个氨基酸,具有(α/β)8桶状结构,并且还含有三个可变的Loop环结构。(2)BclAKR4C10基因编码蛋白:相对分子量为35.280 k Da,理论等电点为5.77;信号肽预测结果表明,该蛋白没有信号肽切割位点,为非分泌蛋白;亲疏水性分析表明:BclAKR4C10蛋白平均亲/疏水性指数为-0.248,预测该基因为亲水性蛋白;跨膜区分析预测该蛋白无跨膜区存在;磷酸化位点预测结果表明,该蛋白有8个Ser磷酸化位点、3个Thr磷酸化位点、2个Tyr磷酸化位点。二级结构预测表明,该蛋白α螺旋占40.63%,延伸链占14.60%,β转角占6.67%,无规则卷曲占38.10%。(3)BclAKR4C10基因亚细胞定位:将BclAKR4C10基因构建到p BI121-e GFP-HA载体中,经PCR检测及测序验证后,证实p BI121-BclAKR4C10-e GFP-HA载体构建成功。亚细胞定位结果表明,BclAKR4C10蛋白产生后分布于细胞核和细胞膜中,说明BclAKR4C10基因在细胞膜和细胞核中表达。通过对BclAKR4C10基因的亚细胞定位研究,初步明确了BclAKR4C10基因在菜心抗炭疽病过程中的可能作用位置,为进一步研究菜心抗炭疽病分子机制和控制炭疽病的发生提供了理论依据。(4)BclAKR4C10基因荧光定量表达分析:通过接种与不接种炭疽病菌的菜心叶片0 h、6 h、12 h、24 h、48 h时的荧光定量表达分析,菜心BclAKR4C10基因在炭疽病不同侵染时期的相对表达量存在明显差异。BclAKR4C10在对照组(不接种)始终低水平表达,而炭疽菌侵染24 h后BclAKR4C10表达量显著高于其他时期,是对照组的3倍左右,侵染后48h BclAKR4C10的表达水平有所回落,但仍高于0 h~12 h的表达量。通过分析BclAKR4C10基因在炭疽菌侵染不同时期的表达量差异,说明了BclAKR4C10基因与菜心抗炭疽病存在着密切关系。(5)BclAKR4C10基因VIGS载体构建:将BclAKR4C10基因构建到p TRV2载体中,经PCR检测及测序验证后,证实p TRV2-BclAKR4C10载体构建成功,后将该载体转入菜心植株中,经q PCR验证证实该载体成功使目标基因的表达降为对照组的10%,成功建立起菜心VIGS体系,这对于验证菜心BclAKR4C10基因在菜心抗炭疽病中的功能提供了稳定的试验材料。
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