肝癌（主要是肝细胞癌，hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第三位癌症杀手，在我国更高居第二位。手术切除仍为肝癌最有效的疗法，但即使根治性切除，5年内仍有60％～70％的转移复发率，成为进一步提高疗效的瓶颈。对部分不能切除肝癌，局部治疗是一种选择，但同样遇到高转移复发率。肝癌是多血管的实体瘤，为此，抗血管生成是一条有希望的途径。我所王鲁等发现干扰素α（IFNα）通过抑制血管生成而减少肝癌的转移复发，其机理是下调血管内皮细胞生长因子（VEGF）。临床随机对照研究亦证实IFN-α可推迟肝癌术后的复发，成为预防肝癌术后复发的常规之一。我们的临床随机分组研究发现肝癌切除术后给予IFNα治疗可延长患者的生存，推迟复发；但与对照组相比复发率并未降低（用药期间生存率提高了，停药一个阶段后生存率才降低到对照组水平）。因此我们推测IFNα在治疗早期可抑制复发病灶生长，但在后期，肝癌可能对IFNα治疗产生耐药性，因此肿瘤重获生长。如能弄清肝癌对IFNα治疗耐药的机制，将有助于设计新的治疗方案，克服肝癌对IFNα的耐药，以提高IFNα治疗肝癌的疗效。本课题是在此基础上，通过我所建立的高转移人肝癌原位移植裸鼠模型LCI-D20，模拟临床治疗模式，探讨IFNα治疗一段时间停药后是否能够继续使用，再次应用是否能够达到和第一次同样的治疗效果（目的在于回答临床工作中产生的问题，即是否可以对肝癌术后应用IFNα治疗18个月停药后复发病人再次使用IFNα治疗），通过对IFNα第一、二次治疗前、后血管生成相关基因表达谱异同的分析和验证，分析复发肝癌对再次应用IFNα治疗所产生逃逸的分子机制，试图找到克服肝癌对治疗逃逸的方法。1．IFNα停药后再治疗不能有效地抑制肝癌生长和降低微血管密度MVD根据我所前期的实验结果，IFNα在剂量为1.5×10.⁷ .U／kg／d时能有效地抑制高转移人肝癌原位移植裸鼠模型LCI-D20的生长。本次实验中这一剂量在最初治疗的20天中，IFNα治疗组和对照组在肿瘤大小（0.27±0.19 g versus0.68±0.24 g）、微血管密度[22／HP（95％CI=15-29）versus 46／HP（95％CI=32-60）]和血清VEGF浓度（24.5±8.7 pg／ml versus 41.6±12.0 pg／ml）等方面均有显著差异，P＜0.05。停药20天后，肿瘤大小、微血管密度和血清VEGF浓度在两组间的差别已没有统计学意义（P＞0.05）。按照实验设计再次给予IFNα治疗（1.5×10.⁷ .U／kg／d）20天，与对照组相比，再次治疗组的血清VEGF浓度明显减少（58.0±13.7 pg／ml versus 92.8±24.3 pg／ml，P=0.012），但肿瘤大小（3.22±0.62g，3.81±0.92 g）和微血管密度[61／HP（95％CI=48-74），70／HP（95％CI=59-81）]与第一次治疗不同，没有明显的减少（P＞0.05）。2．肝癌前负荷在一定范围内对IFNα的治疗没有明显影响考虑到IFNα第一次和第二次治疗时肝癌的重量不同，为了证实给药前肝癌的重量是否对IFNα治疗产生影响，一组高转移人肝癌原位移植裸鼠模型LCI-D20在无任何干预的情况下生长30天，此时肿瘤大小与IFNα第二次治疗时相近（约1.5g），给予IFNα治疗（1.5×10.⁷ .U／kg／d）20天，与对照组相比，肿瘤重量（2.28±0.63 g versus 3.90±0.80 g）、微血管密度[39／HP（95％CI=30-48）versus 67／HP（95％CI=45-89）]和血清VEGF水平（44.9±10.6 pg／ml versus76.1±15.6 pg／ml）均显著降低（P＜0.05）。3．IFNα治疗不同时间点血管生成相关基因表达差异的研究利用Super Array血管生成相关基因芯片，我们对IFNα第一次治疗前、后和第二次治疗前、后血管生成相关基因的表达谱进行了分析。与治疗前相比，IFNα第一次治疗后有多个促血管生成因子表达下调，如VEGF、angiogenin、bFGF、PDGF-A、TGF、TNF、G-CSF、EGF、IGF、IL-8。IFNα第二次治疗后，除PDGF-A基因表达上调外，其他几个促血管生成因子表达再次下调。4．Real-time PER和Western blot分析VEGF165和PDGF-A在IFNα第一、二次治疗前、后的表达。考虑到血管周细胞对血管内皮细胞具有重要的支持和信号传导作用，而PDGF／PDGF受体在周细胞的信号传导中具有重要意义，因此将下一步实验研究的重点放到了VEGF165和PDGF-A基因和蛋白水平的检测上。通过探针法real-timePCR和Western blot检测发现，VEGF165在第一次和第二次IFNα治疗过程中表达均下调，并且伴有VEGF受体2（Flk-1）磷酸化水平的降低。这些结果表明VEGF／VEGF受体信号传导通路在前后两次治疗中均被有效地抑制。PDGF-A在第一次治疗中表达下调，在第二次治疗中表达反而上调。5．IFNα第二次治疗联合PDGF受体抑制剂imatinib显著降低肿瘤的大小和微血管密度。为了验证PDGF-A上调是IFNα第二次治疗效果差的原因，在IFNα第二次治疗过程中联合应用了PDGF／PDGF受体抑制剂imatinib（100mg／kg／d）治疗20天。结果表明联合用药组的肿瘤大小（2.23±0.43 g）、微血管密度[42／HP （95％CI=32-52）]，与IFNα单纯再次治疗组[3.22±0.62 g，61／HP （95％CI=48-77）]相比均显著降低，更显著低于对照组[3.81±0.92 g，70／HP （95％CI=59-81）]。6．缺氧诱导因子（HIF）1α、2α在各组中和不同细胞系缺氧状态中的表达肿瘤的非限制性增生导致瘤体内缺氧，促使HIF-1α、HIF-2α表达上调。其中HIF-1α是VEGF高表达的主要转录因子。Western blot检测结果显示，IFN-α第一次治疗后HIF-1α、HIF-2α的表达水平均显著降低，停药20天后HIF-1α、HIF-2α的表达水平则明显升高。与对照组相比，HIF-1α表达水平在IFNα再次治疗时仍可以被有效地下调；与第一次IFNα治疗不同，HIF-2α的表达水平在IFNα再次治疗时不再被下调。在正常氧浓度培养条件下，Hela、MHCC-97L、MHCC-97H细胞均只表达较低的HIF1α、HIF2α。当在低氧浓度（1％O₂）下培养5h后，HIF1α、HIF2α表达在3种细胞系中均显著升高。7．超声造影能够显示抗血管治疗对肝癌血流灌注的影响。治疗组裸鼠在给药前、给药的第3天、8天、18天、32天分别进行微泡超声造影，利用软件给出造影强度随时间变化的造影时间强度曲线（TIC曲线），通过公式求出主要参数：产生显影的时间（AT）、达到峰值强度的时间（TTP）及峰值强度（PI）、曲线下面积（AUC）等数据。在拟合回归分析曲线中给出基础强度BI，缩放因子α1，下降曲率α2，阶段曲率α3。通过统计分析发现，在对照组随着肿瘤的增大，AUC有由低到高、再逐渐降低的趋势，而VEGF受体抑制剂Pazopanib治疗组则逐渐降低，给药8天后两组相比有统计学差异。AT在对照组随着时间的延长急剧降低，在治疗组降低的速度明显缓慢。统计分析显示，AUC与MVD正相关，AT与MVD负相关，PI与MVD没有相关性。结论1．IFNα第二次应用治疗肝癌时不能有效地抑制肿瘤的生长和降低微血管密度，肝癌对IFNα再次治疗产生逃逸。2．IFNα治疗高转移裸鼠人肝癌的疗效不受初始治疗时肿瘤负荷影响。3．促血管生长因子PDGF-A在IFNα再次治疗高转移裸鼠人肝癌时高表达，与IFNα再次治疗抑瘤效果差有显著的相关性，此时肝癌血管生成由VEGF依赖转化为PDGF-A依赖。IFNα再次治疗高转移裸鼠人肝癌时联合应用PDGF受体抑制剂imatinib可显著提高治疗效果。4．超声造影技术能够较好地反映肿瘤生长和治疗过程中血流灌注的变化，时间强度曲线下面积（AUC）和造影剂开始显示的时间（AT）分别与微血管密度正相关和负相关，两者有可能作为抗血管生成治疗疗效检测的指标。应用价值1．IFNα先后两次治疗高转移裸鼠人肝癌前后不同时间点血管生成相关基因表达谱发生改变，有利于对抗肝癌血管生成治疗耐药机制的深入研究。2．IFNα再次治疗高转移裸鼠人肝癌时联合PDGF受体抑制剂imatinib可显著提高治疗效果，为临床合理选择抗血管生成药物的使用提供了线索。3．超声造影具有较强的可操作性和较好的依从性，有助于动态观察抗血管治疗的效果，使及时发现耐药性和选择新的抗血管生成药物成为可能。创新点1．首次发现并提出促血管生长因子PDGF-A在IFNα再次治疗高转移裸鼠人肝癌时高表达，血管生成由VEGF依赖转化为PDGF-A依赖，与肝癌对IFNα再次治疗产生逃逸密切相关。2．首次提出IFNα再次治疗肝癌时联合PDGF受体抑制剂imatinib可显著提高治疗效果。3．首次应用超声造影动态检测抗肝癌血管治疗的效果，并提出AUC与MVD正相关，AT与MVD负相关。