一、研究的背景骨缺损常见于外伤、骨肿瘤等原因,缺损的修复是目前骨外科最常见的问题之一,特别是大片骨的缺损,更是临床上骨修复面临的一大难题。目前的修复主要有自体骨修复、异体骨修复和人工骨修复几种方式,自体内修复因来源不足并且要面临再次缺损和感染的风险,临床上应用有限；异体骨主要问题是免疫排斥难以成活等原因也比较少用；而人工骨避免了以上二种情况的缺点,被临床大量应用。但就目前而言,人工骨也面临着缺少生物活性等缺点,现在很多科学家正在寻找新的方法,在实验室里培育具有活性的人工生物骨材料,来为临床骨缺损提供理想骨性替代材料。目前生物骨性材料的研究主要是种子细胞和细胞附着物。细胞一般有胚胎干细胞、间充质干细胞和成体细胞,而细胞附着物一般是有骨特性的物质,如羟灰石,凝胶,也有我们常见的钛片。主要是将这些细胞附着在这些物体上,然后加以诱导培养,让这些细胞变成为某一组织器官的细胞,以达到器官缺失或功能的修补。最近常听说人造耳朵或人造某某器官,就是用此方法得来的。就目前用作培养的细胞而言,胚胎干细胞因为取之不方便,培养条件要求高,多向分化功能强大不好控制(实验室常见会自动分化成不同的细胞,如心肌细胞等),再加上伦理等原因,其实很少被用来当作诱导细胞,而成体细胞因其高度分化,在培养环境下容易老化,也很少被作用研究使用。而间充质干细胞,因其有分化能力,取之方便(很容易自身提取),无伦理道德之约束,容易培养而被广泛用作人工材料的研究。如何在实验室里将间充质干细胞诱导成我们的目的细胞,并且具备一定的功能,越来越多的科研工作者对此十分感兴趣,并逐步深入研究,有的已取得一定的成果。就间充质干细胞成骨诱导而言,已有很多研究者作出了大量的工作,他们在研究的过程中发现一些基因在干细胞成骨分化上起到一定的作用,如内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)等一些因子,在分化过程当中起到非常重要的作用。然而研究者们更深入的研究发现,在这些因子影响细胞的同时,还有一类小分子也在调控着这些基因,这些小分子就是1microRNA。microRNA (miRNA)是一类长度为19～25个核苷酸的非编码单链小RNA分子,参与基因转录后的调节,一般通过靶基因的3’端非翻译区部分互补配对的结合方法来调节调控基因。在生物的生命进程中,广泛参与细胞增殖,生长发育,细胞分化及器官形成等。在生物体生长发育中发挥重要的调控作用。特别是在干细胞的多向分化的调控作用上,有着非常明显的变化,并且越来越受到关注。miRNA是由Lee等在1993年研究线虫的发育过程当中首先发现的,它们是一类非编码的小分子RNA,它们广泛存在于植物和动物体内,长度为19～25个核苷酸。这些长为20nt左右的RNA是被最终剪接而成的成熟体。起初它们在细胞核中转录成初级产物,这些产物被一种叫作RNase Ⅲ Drosha的酶切割成前体,它们的前体是由大约90nt的小分子RNA组成的一个发夹结构,并且在exPortin-5蛋白的作用下,被从细胞核转运到细胞质里面来,最后被RNase Ⅲ Dicer进一步切割,然后变成成熟体,成熟体与其它的蛋白结合,形成RISC复合体,然后一起作用于目的基因的3’端,互补结合,起到抑制目的基因表达的作用,但最新的研究也发现,有些miRNA还可以与目的基因的启动区结合,起到促进目的基因表达的作用,但目前所发现的一千多个miRNA来说,绝大多数是在目的基因3’端结合,起到调控目的基因表达的。在对miRNA的研究中,很多科研工作者已发现了一些miRNA的重要作用,如miR-185不仅对分化产生影响,而且还对细胞耐辐射有一定的作用。还有如miR-21对细胞的凋亡有很明显的作用,很多人设想将其用于癌症治疗。还有一些小分子对器官的发育有一定的作用。由于miRNA在不同的条件下表达水平不一样,比如细胞癌变时,表达高,正常细胞表达低,现在有临床上把有些miRNA作为愈后的一项指标来判断疾病的康复情况。就转化生长因子TGF-β1而言,已有实验证明它在干细胞分化的过程当中起到重要的作用,不仅在成肝细胞、成心肌细胞起到重要的作用,且在成骨诱导方面也有所报道,这说明转化生长因子在生命进程中,对分化起到重要的作用。然而,我们知道,生命的进程最终是走向衰老的,这是不是说明在分化过程中,转化因子的作用慢慢减退了,这让我们想到了是不是有什么在调控这些因子的作用,而最新的miRNA可以调控基因的成果提示我们,会不会是因为miRNA的作用而使基因的功能减弱呢?带着疑问,我们利用mirBASB进行查询,发现miR-185与TGF-β1有潜在调控位点,再查询了最新的文献发现目前没有这方面的报道,鉴于以上好奇,于是我们选用miR-185展开研究。二、研究的内容首先我们从基因组中克隆出了miR-185,将克隆片段连接到慢病毒载体上,然后连同其它包装质粒一起转入慢病毒包装细胞293T细胞里,包装成慢病毒颗粒,然后再去感染人骨髓间充质干细胞,通过筛选得到稳定细胞株,增殖并备用。然后我们化学合成了干扰片段,将miR-185沉默掉,转入人骨髓间充质干细胞作为反向对照,看miR-185在细胞成骨分化中所起的作用。同时,我们包装了不含miR-185而只含GFP的病毒作为对照组,展开实验。1、过表达miR-185和抑制miR-185对人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用目的：检测过表达miR-185和抑制miR-185对人骨髓间充质干细胞成骨分化能力方法：构建过表达miR-185和抑制miR-185的慢病毒载体,包装成可以感染目的细胞的慢病毒颗粒,分别感染HMSCs细胞,将细胞分别设为三组,并在成骨分化诱导液里诱导培养20天后,分别行茜素红染色,观察成骨情况,并进行定量分析(图3-5、图3-6)。结果：通过茜素红染色表明,过表达miR-185对细胞成骨分化有明显的抑制作用,而抑制miR-185的表达,对细胞成骨分化显著增强。这些结果表明,miR-185在细胞成骨分化中起到重要的调节作用。结论：上调miR-185表达能够降低干细胞的成骨分化能力,抑制miR-185表达显著增强干细胞成骨分化能力。2、过表达miR-185和抑制miR-185对人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性影响目的：检测过表达miR-185和抑制miR-185对人骨髓间充质干细胞ALP活性能力方法：将感染了表达miR-185和抑制miR-185慢病毒的细胞,分别设为三组,并在成骨分化诱导液里诱导培养14天后,进行ALP染色并处理细胞测OD值,作定量分析。结果：实验显示,抑制miR-185组染色明显要比过表达miR-185实验组深,同时酶标仪测OD值提示,抑制组的活性显著高于过表达组,结果表明,在体外实验中,miR-185可能起到调节细胞基因的重要作用(图3-7、图3-8)。结论：上调miR-185表达能够降低细胞的碱性磷酸酶活性,抑制miR-185表达显著增强细胞碱性磷酸酶活性(P<0.05)。3、过表达miR-185和抑制miR-185对人骨髓间充质干细胞成骨相关基因水平的影响目的：检测过表达miR-185和抑制miR-185对人骨髓间充质干细胞基因OCN、 OSterix、OPN表达水平。方法：将感染了表达miR-185和抑制miR-185慢病毒的细胞,分别设为三组,并在成骨分化诱导液里诱导培养20天后,收集细胞并提取RNA,采用基因定量技术(QPCR)检测不同组别OCN、OSterix、OPN表达水平。结果：基因定量检测结果表明,相对于对照组,过表达miR-185组对成骨特性基因OCN、OSterix、OPN表达水平低(图3-9)；而在抑制miR-185组中,相对于对照组,OCN、OSterix、OPN表达水平显著要高(图3-10)。结果表明,miR-185可能在对细胞影响或促进分化的基因起到一定的调控作用。结论：上调miR-185表达能够降低成骨特性基因OCN、OSterix、OPN表达水平,抑制miR-185表达则基因OCN、OSterix、OPN的表达显著提高(P<0.05)。4、过表达miR-185和抑制miR-185对人骨髓间充质干细胞成骨相关蛋白的影响目的：检测过表达miR-185和抑制miR-185对人骨髓间充质干细胞OCN、DMP1、OPN蛋白表达水平。方法：将感染了表达miR-185和抑制miR-185慢病毒的细胞,分别设为三组,并在成骨分化诱导液里诱导培养20天后,收集细胞并抽提蛋白,采用WB技术检测不同组另OCN、DMP1、OPN蛋白表达水平。结果：WB检测结果表明,相对于对照组,过表达miR-185组对成骨特性基因OCN、 DMP1、表达水平低,OPN的表达则不太明显；而在抑制miR-185组中,相对于对照组,OCN、DMP1、OPN表达水平显著要高(图3-11、图3-12))。结果表明,miR-185在成骨分化中扮演重要的调控基因的作用。结论：上调miR-185表达能够降低蛋白OCN、DMP1表达水平,抑制miR-185表达则蛋白OCN、DMP1、OPN的表达显著提高(P<0.05)。5、miR-185与TGF-β1调控关系检测目的：探寻miR-185在基因调控中针对靶基因TGF-β1调节作用。方法：使用TargetScan软件工具miR-185目标预测分析表明,TGF-β1是miR-185潜在目标(图4-2)。为了进一步验证miR-185与TGF-β1相互之间存在的关系,我们克隆了TGF-β1 3’UTR片段,含有miR-185结合位点的PGL3荧光素酶载体,同时我们克隆了TGF-β1 3’UTR突变载体,具体突变了二个碱基,见(图4-3)。通过荧光素酶活性检测表明,miR-185过表达组明显低于对照组。结果：荧光素酶检测表明,miR-185过表达与对照组中荧光值存在明显差异性(P<0.01),而在突变体却无此差异性。结论：基因TGF-β1是miR-185调控靶基因。统计学处理：所有数据使用SPSS13.0统计软件包进行数据处理。两个样本均数比较采用Independent-SampleTtest进行检验,多个样本均数比较采用One-way ANOVA分析,多样本均数两两比较采用LSD法,结果柱状图中的误差条均为标准差,检验水准P<0.05有统计学意义。