论文部分内容阅读
动脉发生栓塞是血栓类疾病(如心肌梗塞)的一个重要原因。溶栓治疗被认为是治疗血栓最为有效的方法,临床上所用的溶栓药物大多为纤维蛋白溶解酶原(简称纤溶酶原)激活剂类药物,它们可以将纤溶酶原转化为纤溶酶,纤溶酶可以溶解栓塞位置的纤维蛋白,从而恢复血液的畅通。目前常用的溶栓药物有链激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)、重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)、对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物(APSAC) 和重组链激酶(r-SK)等,它们的溶栓疗效肯定,但是还存在一些缺陷(如初始再灌注延迟或失败、出血、再梗塞等),阻碍了溶栓疗效的进一步提高。因此,随着对溶栓药物结构和功能的研究,寻找和研制溶栓效率高、特异性强、具有纤维蛋白选择性、半衰期长的溶栓治疗药物对于更有效治疗血栓性疾病具有十分重要的意义。尿激酶原(pro-UK)是单链的u-PA,属于丝氨酸蛋白酶,能够激活纤溶酶原,使之成为纤溶酶,从而溶解血栓。体内和体外的实验均证明当用量控制在一定范围时,pro-UK 可以使纤维蛋白特异性溶解,但用量加大时,pro-UK 就转化为尿激酶(UK),失去了对纤维蛋白的特异性。对pro-UK 的研究表明,它由411 个氨基酸残基组成;经激肽释放酶或纤溶酶激活可在Lys158-Ile159 断开形成UK;凝血酶可催化pro-UK 的Arg156-Phe157 之间肽键的水解,产生凝血酶断裂型的UK 双链,该双链仅具有微弱的激活纤溶酶原的活性;为了防止系统性纤溶,pro-UK 受到纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)的调控;PAI-1 可通过与pro-UK 共价结合形成复合物而使之失活,是pro-UK主要的抑制剂;一项研究显示pro-UK 表面可变环中的许多带正电荷氨基酸残基(R178RHRGGS184)可与PAI-1 分子中的带负电荷氨基酸残基形成“盐桥”,该盐桥在pro-UK 与PAI-1 结合过程中起决定性作用;用苯甲酰甲醛处理pro-UK,改变四个Arg 残基可使衍生物在血浆中最稳定,且具有更高的溶栓活性,推测该四个Arg残基中有3 个位于pro-UK 表面的可变环(R178RHRGGS184)中。基于以上结果,本研究设计带有突变位点的引物,以天然pro-UK cDNA为模板,采用PCR 介导的定点突变技术对pro-UK 基因进行了突变,构建了三种人pro-UK 的突变体,分别将蛋白序列中的凝血酶作用位点Arg156 突变成His156 ,构建成pro-UKM1;将PAI-1 的作用位点Arg178、Arg179、Arg181 突变为Lys178、Lys179、His181构建成pro-UKM3;同时将凝血酶和PAI-1 的作用位点突变构建成pro-UKM13。由于蛋白翻译后修饰(糖基化、形成二硫键、亚基组装等)对产物的性质至关重