【摘 要】
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背景高能量损伤、骨感染及骨肿瘤患者中常存在大面积的骨缺损,而修复材料的匮乏一直是临床面临的难题之一。传统骨修复材料因其各自的不同缺点导致其临床使用受限。近年来,随着细胞生物学和材料科学研究不断深入,以种子细胞、生长因子、生物材料为主要要素的组织工程骨为临床骨缺损的修复提供了新思路。脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）是一类具有多向分化潜能的成体干细胞,
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（U1601221）； 广东省组织构建与检测重点实验室（2020B1212060037）；
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背景高能量损伤、骨感染及骨肿瘤患者中常存在大面积的骨缺损,而修复材料的匮乏一直是临床面临的难题之一。传统骨修复材料因其各自的不同缺点导致其临床使用受限。近年来,随着细胞生物学和材料科学研究不断深入,以种子细胞、生长因子、生物材料为主要要素的组织工程骨为临床骨缺损的修复提供了新思路。脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）是一类具有多向分化潜能的成体干细胞,可以分化为多种不同性质及功能的细胞,已被广泛应用于组织工程治疗领域。不同于传统单一生长因子,近年来血小板源性生物制剂富血小板血浆（Platelet rich plasma,PRP）因其来源安全、富集多种生长因子的优势被广泛用于临床以改善骨愈合,但其传统激活及应用方法存在生长因子爆释、结构不稳定、外源添加剂等诸多问题。甲基丙烯酸酰化明胶（GelMA）是生物合成的具有一定强度的多孔网状结构水凝胶,其易于交联和改性的特点让生长因子易于负载,是种理想的生物支架,已被广泛用于心肌、骨骼肌组织等的修复中。目的制备一种复合PRP的新型水凝胶,该材料作为生物支架为具备一定强度的三维多孔网状结构,能够通过温度感应的方式热激活PRP并缓释其中生长因子,以适应成骨过程各阶段对生长因子和骨长入支架的需求,体外促进ADSCs长期成骨,在体内促进骨缺损的修复。方法1.利用枝接反应合成超弹性冷冻水凝胶的前体甲基丙烯酸酰化明胶（GelMA）;Landerberg法制备大鼠富血小板血浆（PRP）并测定血小板浓度;PRP与GelMA冷冻聚合,形成不同浓度梯度的PRP-Cryogel;检测各组PRP-Cryogel生物学特性及表征,筛选出最佳浓度;PRP-Cryogel激活后生长因子释放曲线测量并与传统凝血酶激活的PRP凝胶做对比;2.提取SD大鼠脂肪源性干细胞（ADSCs）并传代扩增,并鉴定其干细胞特征;ADSC在生物水凝胶支架中的三维培养,各复合组织工程支架中ADSCs增殖、成骨分化能力的检测;PRP-Cryogel在体内和体外的生物相容性检测。3.动物分为五组,分别为空白对照组、Cryogel组、Cryogel+ADSCs组、PRP-Cryogel组和PRP-Cryogel+ADSCs组,制作大鼠颅骨骨缺损模型并植入组织工程骨材料,8周后取出标本并进行各组骨影像学分析及组织学检测。结果1.基于明胶复合PRP制备成的冷冻PRP水凝胶（PRP-Cryogel）,通过红外光谱分析证实其聚合成功,扫描电镜对5种不同浓度冷凝胶的微观结构观察后发现Cryogel、PRP-1-Cryogel、PRP-2-Cryogel形成三维多孔网状结构,复合PRP使水凝胶的溶胀率和力学强度得到提高,PRP-2-Cryogel尤为明显,且在PBS中浸泡30天后质量仍保持在20%以上.2.ELISA法测定传统PRP凝胶在前3天释放出大量高浓度生长因子,8天后浓度明显降低,释放减少。37℃温度活化的新型生物水凝胶中TGF-β和PDGF在一月内得到稳定缓慢的释放,PRP-2-Cryogel释放效果更好。通过流式细胞仪检测制备的PRP、未活化的PRP-2-cryogel和37℃活化的PRP-2-cryogel中cd63阳性血小板的激活百分率分别为9.5%、33.0%和73.1%,表明制作过程影响较小,大部分血小板是通过温度激活的。3.分离纯化的ADSCs经鉴定为干细胞,成脂诱导后油红O染色阳性,成骨诱导培养后茜素红S染色阳性,具有成骨分化潜能。在新型水凝胶三维支架上培养的ADSCs,通过扫描电镜形态学观察呈良好的生长扩增趋势,活/死细胞染显示PRP-2-cryogel胶培养的ADSCs细胞存活率明显高于其他组,CCK-8法测定和体内实验证明PRP-2-cryogel对细胞和组织的生物相容性最好。4.在成骨诱导下体外培养时,ADSCs成骨分化早期指标碱性磷酸酶（ALP）表达水平PRP-2-cryogel组最高;成骨分化后期指标骨桥蛋白（OPN）通过qPCR检测及免疫荧光分析观察各组表达均增加,而PRP-2-cryogel组表达量最高。茜素红S染色研究结果也显示PRP-2-cryogel的促成骨能力更明显。油红O染色显示,在三种生物支架上培养ADSCs时,没有产生脂肪细胞,脂肪细胞对骨修复过程是有害的。5.制作大鼠颅骨缺损模型并植入新型复合水凝胶材料后8周,根据影像学和组织切片结果进行评估分析,结果表面PRP-2-cryogel的骨修复效果优于cryogel+ADSCs,而 PRP-2-cryogel+ADSCs 组修复效果最好。结论温度激活的复合水凝胶（PRP-Cryogel）具有理想的三维多孔网络结构,生物相容性良好,可在37℃通过温度激活PRP缓释生长因子,从而促进ADSCs的体外增殖及成骨分化,体内实验表明该材料可以促进大鼠颅骨临界骨缺损的快速修复,体内外的实验结果证明PRP-Cryogel具有良好的应用前景,具备作为理想的组织工程骨的条件。
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