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抑郁症是一种常见的心境障碍,在人的一生中,抑郁症发病率约为12%-17%,预计到2020年将成为世界上首位致残原因。抑郁症以其高发病率、高复发率以及自杀倾向(90%的自杀源于抑郁症),成为一个严重的公共卫生问题。然而,目前仍不清楚抑郁症的发病机制。在抑郁症的药物治疗上虽取得了一定的进步,如5-羟色胺和/或去甲肾上腺素再摄取抑制剂等都具有较好的疗效和安全性。但事实上,仍然面临诸多严峻挑战:第一,用药依从性差:现行的抗抑郁药物起效慢,需要至少3-6周才起效,而患者很难坚持到取得疗效就放弃了治疗;第二,药物有效率低:超过35%的抑郁症患者对目前的治疗不产生反应,即药物抵抗;第三,严重的药物毒副作用及停药后高复发率。因此,阐明抑郁症发病机制;寻找起效快、作用持久、副作用少的新型抗抑郁药物/方法是当前抑郁症研究的关键科学问题。环氧二十碳三酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)为花生四烯酸在细胞色素P450环氧化酶催化作用下产生的重要代谢产物,是一类近几年备受重视的具有强大生物活性的内生性脂质环氧化合物。它具有广泛的生物学功能,包括减轻炎症反应、抑制血小板聚集、缺血后的神经保护、促进血管生成、扩张血管调节肾小管运输等。可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)是使EETs代谢和失活的主要酶类。sEH是一个双功能酶,具有羧基末端水解酶功能和氨基末端的磷酸酶活性,在哺乳动物的血管、肝脏、肾脏、心脏、脑等组织中广泛存在。它最早于1973年由Gill等在研究类似昆虫保幼激素萜类环氧化物的代谢时发现的,因其主要位于细胞的可溶性成分如细胞质和过氧化物酶体中而命名。sEH可将具有强大生物学活性的环氧二十碳三酸(EETs)转换为低生物活性的二羟基二十碳四烯酸(DHETs)。基于EETs生物学功能及sEH的作用机制,sEH抑制剂(sEH inhibitors,sEHI)能减少EETs降解,增加生物体内EETs水平,提高EETs的有益特征。因此,sEHI作为具有治疗炎症相关疾病、心血管疾病及脑缺血可能性的药物被广泛研究。例如:多项研究证明EETs具有抗炎作用。同时服用非甾体类抗炎药及sEHI具有联合抗痛、抗炎作用并可减轻不良反应,其机制在于减少了各种炎症因子如前列腺素、环加氧酶-2蛋白的产生。另有研究发现,sEHI可减弱吸烟相关的炎症反应,其可能机制为通过抑制细胞黏附分子表达、抑制白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞在血管壁黏附,减少促炎环氧衍生物在外周形成从而减弱炎症反应,与EETs联合使用是作用更强。另外,有研究表明EETs在高血压和心脏重构中的潜在作用已被sEHI所证实,给予sEHI可预防高血压大鼠收缩压升高、左室湿重增加及内皮功能恶化。EETs可上调动脉内皮的一氧化氮合成酶表达及功能,起到降血压的作用。尽管人们对sEH在心血管疾病、脑缺血及炎症的发生过程中的作用研究已十分广泛,但对于sEH在抑郁症的发病过程中是否起到一定作用及如何发挥作用并没有研究。本课题利用sEH-/-小鼠,并对其进行抑郁相关的行为学检测,观察sEH-/-小鼠是否出现抑郁样或抗抑郁样表型。我们通过对sEH-/-小鼠进行强迫游泳实验和悬尾实验的检测,发现其与WT小鼠相比,表现出较短的不动时间(t检验,n>10,P<0.05),提示我们sEH-/-小鼠表现出抗抑郁样行为。对sEH-/-小鼠及WT小鼠进行了旷场实验,发现它们在运动能力上没有显著的统计学差异(t检验,n>10,P>0.05)。在高架十字迷宫(t检验,n=19或20,P>0.05)及新颖环境下压力进食(t检验,n=12或15,P>0.05)等焦虑相关的实验中,sEH-/-小鼠及WT小鼠的行为学表现均无显著的统计学差异。多项研究表明抑制sEH活性,能提高体内的EETs水平,而在4种EETs中(5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET)以 14,15-EET 活性最高。我们给与C57BL/6J小鼠侧脑室注射14,15-EET以模拟抑制sEH效果,发现增高脑内14,15-EET水平可显著降低小鼠在强迫游泳实验中的不动时间(ANOVA,n=9或10,P=0.001),即诱导小鼠产生抗抑郁样行为。其中0.25ug组及4ug组较对照组有显著的统计学差异(P<0.01)。而侧脑室注射14,15-EET并不会影响小鼠的自主运动能力,在旷场实验中,对照组小鼠及给药组小鼠在运动总路程及站立次数上均没有表现出显著的统计学差异(ANOVA,n=11或12,P>0.05)。14,15-EE-5(Z)E是EETs拮抗剂,能有效抑制EETs的生物学活性。为进一步验证sEH-/-小鼠的抗抑郁样行为的确由于脑内EETs水平升高所致,我们对sEH-/-小鼠进行侧脑室注射14,15-EE-5(Z)E(10ug/只)以降低脑内EETs水平并检测其在强迫游泳中的表现,结果显示注射14,15-EE-5(Z)E后,sEH-/-小鼠的不动时间明显延长(t检验,n=9,P=0.006),即sEH-/-小鼠在强迫游泳中的抗抑郁样行为被侧脑室注射14,15-EE-5(Z)E所逆转。该结果证实了 sEH-/-小鼠的抗抑郁样行为乃脑内EETs水平升高所致。综上,我们的研究提示,EETs-sEH系统在抗抑郁效应产生过程中发挥了重要作用。一些对sEH抑制剂的心肌保护作用的机制研究提示我们,在细胞线粒体膜上或者内部可能存在EET受体。线粒体是细胞产生ATP的主要场所,而本实验室前期的课题研究表明,星形胶质细胞来源的三磷酸腺苷(ATP)能调节抑郁样行为(未发表)。社会失败应激模型能降低前额叶皮层及海马释放的ATP水平,并且在小鼠强迫游泳实验、社会失败应激模型及慢性温和应激模型中,腹腔注射ATP均可产生抗抑郁效果。由此,我们提出本课题的另一假说:EETs-sEH系统产生的抗抑郁效果是否与其调节星形胶质细胞释放ATP有关。首先,我们对小鼠星形胶质细胞进行了 sEH的免疫荧光检测,发现sEH在星形胶质细胞中广泛存在。这为我们进一步研究sEH在星形胶质细胞中的功能提供了物质基础。其次,我们利用脑片孵育的方法对sEH-/-小鼠及WT小鼠前额叶皮层及海马释放的ATP含量进行检测。结果显示,sEH-/-小鼠前额叶皮层释放的ATP含量明显高于WT小鼠(t检验,n=15,P<0.001)。再次,我们对新生sEH-/-小鼠及WT小鼠皮层的星形胶质细胞进行原代培养,并对培养基中ATP含量进行检测。发现sEH-/-小鼠的星形胶质细胞释放的ATP水平明显高于WT小鼠(t检验,n=5,P<0.001)。为进一步探索sEH对星形胶质细胞ATP释放的影响,我们利用sEH抑制剂AUDA,对体外培养的SD乳鼠皮层星形胶质细胞进行处理(设立luM组、5uM组)。对照组细胞则进行DMSO处理,处理30分钟后,收集培养基进行ATP含量检测。结果显示,5uMAUDA处理组较对照组ATP含量明显增高,有显著的统计学差异(ANOVA,n=15或16,P<0.01),较1uMAUDA组ATP含量明显增高,亦有显著的统计学差异(ANOVA,n=15或16,P<0.001),对照组与luM AUDA处理组ATP含量没有表现出显著的统计学差异(ANOVA,n=15或16,P=0.271)。上述结果表明,5uM AUDA处理30分钟能明显提高星形胶质细胞ATP释放含量。接下来我们分别对星形胶质细胞进行5 uMAUDA处理5分钟、10分钟、30分钟的星形胶质细胞进行ATP水平检测,结果显示,三个时间点所测得的ATP水平均较对照组(DMSO)高。其中30分钟组较对照组有显著的统计学差异(ANOVA,n≥13,P<0.05)。5分钟及10分钟组与对照组相比,均没有表现出显著的统计学差异(ANOVA,n≥13,P>0.05)。为进一步验证上述AUDA的促ATP释放效果,我们给予星形胶质细胞luM 14,15-EET药物处理(14,15-EET为EETs家族的一种,具有较高的生物学活性),发现该药物亦可促进星形胶质细胞ATP释放(ANOVA,n≥8,P<0.05)。以上实验结果表明:1)sEH-/-小鼠表现出抗抑郁样行为,该抗抑郁样行为能被侧脑室注射14,15-EE-5(Z)E所逆转。2)侧脑室给予14,15-EET可诱导C57BL/6J小鼠产生抗抑郁效果。3)sEH-/-小鼠的孵育脑片及培养的星形胶质细胞均表现出较高的ATP水平。4)sEH的抑制剂AUDA及14,15-EET均可促进星形胶质细胞释放ATP。我们的研究提示,EETs-sEH系统在抗抑郁效应的产生过程中发挥重要作用。