论文部分内容阅读
目的:在引发终末期肾病的各种疾病中,糖尿病肾病占有极大比例,其患病率和死亡率呈现逐年递增的趋势。即使积极给予控制血压及血糖、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统等一系列临床治疗措施,仍有很多病人不可避免地发生糖尿病肾病。由于DN的发病机制的复杂性,虽经过大量实验及临床研究与探索,至今人们仍旧无法完全阐明其发病机理。所以迫切需要进一步对糖尿病肾病的发病机理进行研究,并探究能够在糖尿病肾病发病初期进行治疗的药物。本研究通过研究姜黄素(curcumin)对小鼠肾足细胞系(MPC5)自噬作用的影响,进一步探究姜黄素对糖尿病肾病足细胞是否起到保护作用及其发挥作用的可能机制。方法:采用MTT法检测细胞生存率,最终确定姜黄素作用浓度为1、5、10umol/L。小鼠永生化足细胞系进行体外培养,给予姜黄素(1,5,10u M)预刺激1h后,然后在高糖环境中培养24h。将培养的足细胞分为6组:正常对照组(Normal Glucose,5.5mmol/L)、高糖组(High Glucose,30 mmol/L)、姜黄素低、中、高浓度处理组(High Glucose+Curcumin,1umol/L、5umol/L、10umol/L)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)抑制剂雷帕霉素组(High Glucose+Rapamycin,10nmol/L)。Western blot分别检测自噬相关蛋白及足细胞功能性标志蛋白的表达,其中包括LC3B、Beclin-1、Synaptopodin、Nephrin。另将足细胞分为6组:正常对照组(Normal Glucose,5.5mmol/L)、高糖组(High Glucose,30 mmol/L)、姜黄素低、中、高浓度处理组(High Glucose+Curcumin,1umol/L、5umol/L、10umol/L)、I类磷酸肌醇3-激酶(PI3Ks)抑制剂LY294002组(High Glucose+LY294002,10umol/L)。Western blot检测PI3K/Akt/m TOR信号通路中p-m TOR、p-Akt蛋白表达水平。结果:1.姜黄素刺激对自噬相关蛋白表达的影响Western blot结果显示,高糖组其自噬相关蛋白LC3II/I比值及Beclin-1蛋白表达较正常对照组明显降低;姜黄素组和雷帕霉素组LC3II/I比值及Beclin-1蛋白表达较高糖组明显增高;姜黄素组LC3II蛋白表达随着姜黄素剂量的增加逐渐增加。2.姜黄素维持高糖刺激下足细胞功能性标志蛋白水平Western blot结果显示,与正常对照组相比,高糖组synaptopodin、nephrin蛋白水平明显降低;而与高糖组比较,姜黄素组及雷帕霉素组synaptopodin、nephrin蛋白水平增加。3.高糖环境下姜黄素通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路激活足细胞自噬Western blot结果显示,与高糖组相比,姜黄素组p-m TOR表达水平随着姜黄素剂量的逐渐增加而减少,但LC3II作为P13K/Akt/m TOR信号通路下游分子,其表达情况却明显增加。与高糖组相比,姜黄素组p-Akt表达水平减少,但Beclin-1作为Akt的作用靶点之一,其表达情况却明显增加。结论:1.姜黄素预处理可以改善高糖刺激对小鼠肾足细胞的自噬抑制作用,姜黄素可以剂量依赖的减轻足细胞自噬抑制作用,从而保护足细胞,延缓DN的进展。2.姜黄素维持高糖刺激下足细胞的正常功能,改善肾功能,有望成为糖尿病肾病的新治疗策略之一。3.姜黄素改善高糖刺激的足细胞中的自噬反应与抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路有关。