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背景：帕金森病（Parkinsons Disease，PD）是进展性神经退行性疾病，临床主要表现为静止性震颤、肌肉僵直、站姿不稳等症状。PD的主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺能神经元选择性丢失，及神经元胞体内的α-突触核蛋白（α-Synuclein，αS）异常聚集形成包涵体。一系列研究发现αS在PD的病理过程中发挥关键的致病作用，向正常小鼠脑内注射αS原纤维可模拟PD的病理及运动症状。帕金森病可能始于肠道，临床前证据表明αS可以由肠道运输到大脑通过迷走神经。PD病人的肠道菌群与正常人相比有较大差异，提示肠道菌群可能影响PD的发生发展。流行病学研究表明，长期饮用咖啡和帕金森病的发生率之间呈负相关，并且期间不同的动物实验表明咖啡因在帕金森病模型中有多重保护作用，例如增强运动，潜在的神经保护作用和对帕金森病认知损伤的改善。有研究认为咖啡因的保护作用隐藏在消化道中，更准确地说是在肠道微生物群中。基于实验室前期研究成果和适用于菌群研究的测序技术的快速发展，本论文聚焦于研究肠道微生物在PD疾病中所扮演的角色，以及验证咖啡因是否通过影响肠道微生物发挥保护作用，旨在为PD研究提供新的思路和线索。
目的：
1.对模拟PD病理的A53T突变型αS转基因小鼠（A53T mutantαS transgenic mice，TG）进行行为学实验，探讨小鼠在早期胃肠道功能的改变。通过宏基因组测序，分析模拟PD病理的TG小鼠肠道菌群结构以及代谢通路是否发生改变。
2.基于TG小鼠早期出现胃肠道功能障碍，后期予以咖啡因慢性喂养，通过行为学及生化水平检测，探讨研究咖啡因对TG小鼠的非运动障碍是否具有保护作用；通过宏基因组分析咖啡因对TG小鼠肠道菌群及代谢通路的影响，探讨咖啡因对PD的保护作用是否与肠道菌群相关。
材料方法：
1.行为学检测：试验小鼠分为两组，实验组选用6月龄遗传背景为C57BL/6的杂合子A53TαS转基因小鼠，对照组选用同龄同窝正常野生型小鼠（wild-type，WT）。综合利用1h排便频率和含水量一系列行为学测试方法，探讨PD模型小鼠胃肠道功能的改变，研究PD早期的非运动表型。
2.慢性咖啡因干预：行为学后，再将试验小鼠分为四组，TG+Caffeine：TG鼠喂养咖啡因；TG+H2O：TG鼠喂水；WT+Caffeine：WT鼠喂养咖啡因；WT+H2O：WT鼠喂水。慢性咖啡因喂养1个月后，综合利用1h粪便频率和含水量一系列行为学测试方法，探讨TG小鼠胃肠道功能的改变，研究咖啡因对PD早期的非运动表型是否有保护作用。
3.宏基因组分析：取四组实验小鼠肠道内容物进行宏基因组学测序分析，以研究TG小鼠肠道微生物群落结构以及代谢通路的改变，并且咖啡因对TG小鼠肠道群落结构以及代谢通路是否有影响。
4.Western blot（WB）检测：小鼠脑内ZO-1和Bcl2/Bax的蛋白含量变化，以探究咖啡因对TG小鼠血脑屏障紧密性和神经细胞凋亡的影响。
实验结果：
1.与WT小鼠相比，TG小鼠排便量减少及排便含水量下降（P＜0.05），表明TG小鼠早期存在胃肠功能障碍。通过对小鼠胃肠道内容物进行宏基因组分析，发现TG小鼠的肠道菌群的生物多样性有显著改变，表现在厚壁菌门、拟杆菌门和疣微菌门丰度降低，变形菌门、脱铁杆菌门和放线菌门丰度升高。KEGG代谢通路及CAZyme注释与WT小鼠有显著差异（P＜0.05），主要表现为TG小鼠肠道中生物合成不饱和脂肪酸，磷酸酯和磷酸盐代谢，碳水化合物消化吸收等代谢功能减弱以及碳水化合物活性酶功能富集显著降低。
2.咖啡因慢性喂养TG小鼠和WT小鼠，胃肠功能行为学检测发现咖啡因对TG小鼠及WT小鼠排便量及排便含水量无显著影响（P＞0.05）。但是TG小鼠经咖啡因喂养后部分逆转了由αS诱导的肠道菌群改变，使其恢复至与WT小鼠菌群结构相接近，主要表现为部分常见菌群比例变化，例如幽门螺旋杆菌（Helicobacter）及Mucispirillum属丰度减少，梭菌属（Clostridium）丰度增加。
3.咖啡因慢性干预对WT小鼠及TG小鼠肠道菌群的影响不同，对WT小鼠主要影响的菌群主要有Lactobacillus（P＜0.05），而对TG小鼠部分小丰度菌群产生了差异性改变，例如Coprobacillus和Fusobacterium丰度显著增加（P＜0.05）。同时，咖啡因使TG小鼠肠道碳水化合物活性酶功能富集显著提高（P＜0.05），对WT小鼠的影响则较小。
4.WB检测结果表明，TG小鼠在纹状体，皮层和海马脑区中的ZO-1和Bcl2/Bax的蛋白表达水平无明显变化；经咖啡因慢性喂养对此三个脑区ZO-1和Bcl2/Bax的蛋白表达水平无显著影响（P＞0.05）。
结论：
1.在αS过表达的影响下，肠道菌群的生长环境改变，TG小鼠肠道菌群丰度出现明显改变，肠道消化系统功能降低。
2.咖啡因慢性干预对TG小鼠肠道菌群多样性影响较大，逆转αS带来肠道菌群的改变，使其趋向于与WT小鼠肠道菌群构成相接近，表明咖啡因可能通过调节肠道菌群在PD中发挥作用，但对胃肠功能及血脑屏障的影响并不显著。
3.咖啡因慢性干预对TG小鼠与WT小鼠肠道中KEGG代谢通路和某些碳水化合物活性酶的影响不同，咖啡因在TG小鼠肠道代谢的影响更大，此研究结果为咖啡因对肠道菌群的研究提供两个重要切入点。
目的：
1.对模拟PD病理的A53T突变型αS转基因小鼠（A53T mutantαS transgenic mice，TG）进行行为学实验，探讨小鼠在早期胃肠道功能的改变。通过宏基因组测序，分析模拟PD病理的TG小鼠肠道菌群结构以及代谢通路是否发生改变。
2.基于TG小鼠早期出现胃肠道功能障碍，后期予以咖啡因慢性喂养，通过行为学及生化水平检测，探讨研究咖啡因对TG小鼠的非运动障碍是否具有保护作用；通过宏基因组分析咖啡因对TG小鼠肠道菌群及代谢通路的影响，探讨咖啡因对PD的保护作用是否与肠道菌群相关。
材料方法：
1.行为学检测：试验小鼠分为两组，实验组选用6月龄遗传背景为C57BL/6的杂合子A53TαS转基因小鼠，对照组选用同龄同窝正常野生型小鼠（wild-type，WT）。综合利用1h排便频率和含水量一系列行为学测试方法，探讨PD模型小鼠胃肠道功能的改变，研究PD早期的非运动表型。
2.慢性咖啡因干预：行为学后，再将试验小鼠分为四组，TG+Caffeine：TG鼠喂养咖啡因；TG+H2O：TG鼠喂水；WT+Caffeine：WT鼠喂养咖啡因；WT+H2O：WT鼠喂水。慢性咖啡因喂养1个月后，综合利用1h粪便频率和含水量一系列行为学测试方法，探讨TG小鼠胃肠道功能的改变，研究咖啡因对PD早期的非运动表型是否有保护作用。
3.宏基因组分析：取四组实验小鼠肠道内容物进行宏基因组学测序分析，以研究TG小鼠肠道微生物群落结构以及代谢通路的改变，并且咖啡因对TG小鼠肠道群落结构以及代谢通路是否有影响。
4.Western blot（WB）检测：小鼠脑内ZO-1和Bcl2/Bax的蛋白含量变化，以探究咖啡因对TG小鼠血脑屏障紧密性和神经细胞凋亡的影响。
实验结果：
1.与WT小鼠相比，TG小鼠排便量减少及排便含水量下降（P＜0.05），表明TG小鼠早期存在胃肠功能障碍。通过对小鼠胃肠道内容物进行宏基因组分析，发现TG小鼠的肠道菌群的生物多样性有显著改变，表现在厚壁菌门、拟杆菌门和疣微菌门丰度降低，变形菌门、脱铁杆菌门和放线菌门丰度升高。KEGG代谢通路及CAZyme注释与WT小鼠有显著差异（P＜0.05），主要表现为TG小鼠肠道中生物合成不饱和脂肪酸，磷酸酯和磷酸盐代谢，碳水化合物消化吸收等代谢功能减弱以及碳水化合物活性酶功能富集显著降低。
2.咖啡因慢性喂养TG小鼠和WT小鼠，胃肠功能行为学检测发现咖啡因对TG小鼠及WT小鼠排便量及排便含水量无显著影响（P＞0.05）。但是TG小鼠经咖啡因喂养后部分逆转了由αS诱导的肠道菌群改变，使其恢复至与WT小鼠菌群结构相接近，主要表现为部分常见菌群比例变化，例如幽门螺旋杆菌（Helicobacter）及Mucispirillum属丰度减少，梭菌属（Clostridium）丰度增加。
3.咖啡因慢性干预对WT小鼠及TG小鼠肠道菌群的影响不同，对WT小鼠主要影响的菌群主要有Lactobacillus（P＜0.05），而对TG小鼠部分小丰度菌群产生了差异性改变，例如Coprobacillus和Fusobacterium丰度显著增加（P＜0.05）。同时，咖啡因使TG小鼠肠道碳水化合物活性酶功能富集显著提高（P＜0.05），对WT小鼠的影响则较小。
4.WB检测结果表明，TG小鼠在纹状体，皮层和海马脑区中的ZO-1和Bcl2/Bax的蛋白表达水平无明显变化；经咖啡因慢性喂养对此三个脑区ZO-1和Bcl2/Bax的蛋白表达水平无显著影响（P＞0.05）。
结论：
1.在αS过表达的影响下，肠道菌群的生长环境改变，TG小鼠肠道菌群丰度出现明显改变，肠道消化系统功能降低。
2.咖啡因慢性干预对TG小鼠肠道菌群多样性影响较大，逆转αS带来肠道菌群的改变，使其趋向于与WT小鼠肠道菌群构成相接近，表明咖啡因可能通过调节肠道菌群在PD中发挥作用，但对胃肠功能及血脑屏障的影响并不显著。
3.咖啡因慢性干预对TG小鼠与WT小鼠肠道中KEGG代谢通路和某些碳水化合物活性酶的影响不同，咖啡因在TG小鼠肠道代谢的影响更大，此研究结果为咖啡因对肠道菌群的研究提供两个重要切入点。