流行性感冒病毒属正粘病毒科,流感病毒属,是引起各种鸟类、人、猪、马等哺乳动物发生上呼吸道感染的主要病原。根据其核蛋白(nuclear protein, NP)(?)口基质蛋白(matrix protein, MP)抗原性的不同,流感病毒可分为甲、乙、丙三型。流感每年在全球范围内可致5%-15%的人群感染,约50万人死亡。其中,甲型流感病毒感染范围最广,并可通过多种变异形式逃避宿主免疫从而造成暴发甚至全球性暴发流行,因此危害最大。甲型流感病毒据其两种主要表面抗原血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)结构和基因特性的不同又可分成许多亚型。目前造成人类感染的主要为季节性H1N1、季节性H3N2和新甲型H1N1流感亚型。基于半个多世纪以来的研究成果,现已发展出M2离子通道阻滞剂和神经氨酸酶活性抑制剂(neuraminidase inhibitor, NAI)两类抗病毒药物,而预防感染的三价流感病毒疫苗须每年两次更新候选疫苗株以应对病毒频繁的抗原变异。然而,甲型流感病毒迅速而又无法预期的动态进化仍可导致以下现象发生：(1)间或出现的重大抗原变异导致严重疾病及疫苗株-流行株失匹配；(2)可抵抗现有抗病毒药物的新变异株的增殖；(3)偶见致死性人感染甲型禽流感病毒病例。这些事件发生的进化机制尚未明确。而就在全世界流感监测及研究机构都聚焦于甲型禽流感病毒跨宿主致哺乳动物感染,并可能在人群导致新的流感暴发流行时,2009年4月一株“全新”的甲型H1N1流感病毒感染在墨西哥暴发,并迅速波及全球。由于甲型流感病毒可对人类健康造成持续、而又无法准确预期的威胁,因此甲型流感病毒的进化一直是国内外学者的研究热点。甲型流感病毒基因具有多态性,很大程度上来源于共感染同一宿主细胞的两株遗传距离可能较远的病毒可以发生重配。上世纪最主要的几次大流行之一,1947年的流感大流行即与病毒的重配事件有关,而新世纪首次流感暴发更是来源于一株经过多次基因重配产生的抗原转变株。因此,对甲型流感病毒进行全基因组水平进化研究,全面考虑基因组重配事件及各基因节段的进化动态,比仅仅针对主要表面抗原HA的分子进化研究更为重要。本研究于2005-2011年间采集青岛地区哨点医院流感样病例(influenza-like illness, ILI)鼻咽拭子标本开展流感监测,并采用细胞培养法分离流感毒株；2009年新甲型H1N1流感暴发期间开展紧急监测,采集4个目标人群鼻咽拭子标本进行核酸检测以监控病毒的流行形势。反转录聚合酶链反应(reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)扩增甲型流感病毒的全基因组或部分基因组序列并进行序列测定。通过化学发光法检测流感病毒对NAI类抗病毒药物(oseltamivir,奥司他韦)的敏感性,并分析病毒M2蛋白序列判断病毒对离子通道阻滞剂,即烷胺类药物的敏感性。通过MEGA5.0软件对测得甲型流感病毒全基因组序列进行生物信息学分析,对青岛地区甲型流感病毒的进化规律、耐药株产生原因及分子变异特点进行初步研究；并对青岛地区季节性H3N2流感病毒与全球随机抽取的该亚型病毒HA序列进行进化分析以探讨青岛地区毒株的国际代表性。本研究共得出以下结论：1.本研究于2005-2011年间在青岛地区共采集和监测2560份鼻咽拭子标本,检出245份流感病毒阳性样品,据此了解到近6年来青岛地区季节性H3N2、季节性H1N1、大流行H1N1和乙型流感流行概况：除2007-2008季以乙型为主外,甲型流感病毒是青岛地区流感的主要流行型别。2009新甲型H1N1流感大流行前,基本呈现季节性H1N1、季节性H3N2流感病毒此消彼长的交替流行；新甲型H1N1流感大流行后,季节性H1N1再未分离到,而呈现季节性H3N2、新甲型H1N1共流行态势；本研究同时测定了部分甲型流感病毒全基因组或部分基因组序列,所得数据对流感的防控工作具有重要的指导意义,并可为我国流感病毒的分子流行病学研究提供重要信息。2.2009年新甲型H1N1流感大流行时开展紧急监测,及时跟踪和监视当时疫情状态,并对大流行应对决策制定和风险分析提供支持。对检出的48株来自输入性病例和本土病例的新甲型H1N1流感病毒进行分子流行病学研究,发现本土病例中存在一种HA S128P变异株；进而比对GenBank录入的新甲型H1N1流感病毒序列发现,该变异株于2009年在包括中国、俄国、蒙古及韩国在内的欧亚地区异常传播,在2010年后则随新甲型H1N1流感病毒活动消减而遭淘汰；突变株的“一过性”传播优势提示我们现有知识尚不足以预测流感病毒发展及进化轨迹,唯有继续加强流感病毒监测才可能及时发现突变株以减小病毒所致危害,同时病毒的基因变异、尤其全基因组变异及进化尚需更深入的研究。此外,本研究发现流感大流行期间存在不同型别病毒间共感染情况,提示须警惕不同型别流感病毒发生重配的可能。新甲型H1N1流感大流行期间这一靶向重点人群的紧急监测策略,对于某地区针对未来可能发生的急性呼吸道传染性疾病流行建立早期预警系统具有重要指导意义。3.病毒M2蛋白序列分析发现青岛地区2005-2011年间流行的甲型流感病毒中,除6株奥司他韦耐药季节性H1N1流感病毒外,均在M2基因发生耐药相关的S31N突变,即为烷胺类耐药毒株；NAI敏感性试验发现,目前青岛地区流行的季节性H3N2亚型、新甲型H1N1亚型流感病毒均无奥司他韦耐药性；季节性H1N1流感病毒自2008-2009季出现28.6%比例的耐药株,至2009-2010季耐药株比例升至50%。但2010年以来再未分离到季节性H1N1亚型流感病毒,故NAI类药物对目前流行的流感病毒尚敏感。以上数据表明NAI类药物应作为目前流感临床及预防性用药的首选。此外,我们同时发现了NAI和烷胺类药物双重耐药季节性H1N1流感毒株,该双重耐药株的出现应使我们提高警惕,因其可使现有治疗方案完全失效。4.季节性H1N1流感病毒序列分析表明：病毒抗原变异与病毒流行直接相关,2008-2009季病毒较2005-2006流行季病毒发生多个基因多处位点的突变,使得新生病毒在时隔两个流行季后再次暴发。2009-2010流行季仅在2009年8月底、9月初分离到4株季节性H1N1亚型病毒,病毒较上一流行季毒株未有新增突变发生,故未引起持续的流行,且2010-2011季再无该亚型病毒分离。NAI耐药株除具有NA蛋白H275Y突变外,尚在多个基因节段具有“搭车”突变,这些突变虽不足以提供病毒对NAI药物的耐受性,但它们很可能弥补了NA蛋白H275Y这一突变对病毒生存及传播能力的影响,促进了耐药突变株的生存及广泛传播。5.季节性H1N1、H3N2流感病毒全基因组进化分析发现,两种病毒均存在某一流行季内基因来源不同的两系毒株并存及基因组重配现象,而且2009-2010季的季节性H1N1流感病毒、2010-2011季的季节性H3N2流感病毒基因组全部涉及基因组重配事件,提示重配乃病毒进化的主要方式之一；某一季的优势株常常并非由上一季优势株直接进化产生,而是来自外源基因库的引入；季节性H1N1流感病毒耐药性的产生不仅仅需要NA蛋白H275Y变异和多个基因多处位点的附加变异,还涉及到全基因组的重配事件；青岛地区季节性H1N1流感病毒的进化早于国际疫苗株,则青岛地区毒株有条件作为疫苗候选株；青岛地区2006-2008年季节性H3N2流感病毒两个表面抗原HA和NA基因均与2008-2009季的疫苗推荐株A/Brisbane/10/2007(H3N2)遗传相近,而与当季疫苗株A/Wisconsin/67/2005(H3N2)遗传距离较远,提示可能存在疫苗失匹配现象。6.对青岛地区季节性H3N2流感病毒与全球随机抽取的该亚型病毒HA序列进行进化分析发现,青岛地区流行的毒株具有国际代表性,因此青岛地区毒株可作为全球疫苗推荐株,青岛可作为国际流感监测哨点,在本地区开展流感监测对及时掌握全国乃至全球流感的流行和变异情况具有重要意义。总之,流感的监测网络,尤其暴发流行期间针对目标人群的紧急监测对于急性呼吸道传染性疾病的防控极为重要。病毒的分子变异与每个流行季的病毒流行情况直接相关。NAI类药物应作为目前流感临床及预防性用药的首选,但同时应警惕NAI和烷胺类药物双重耐药流感毒株的出现。基因组重配频繁发生,为流感病毒进化的主要方式之一,流感病毒NAI耐药毒株的出现及广泛传播即不仅仅需要NA蛋白H275Y变异,还涉及到全基因组的重配事件及多个基因多处位点的附加变异。青岛地区流行的毒株具有国际代表性,因而可作为全球疫苗推荐株。尽管由于甲型流感病毒永久存在于野生水禽中致使人类难以彻底消除该病原,但对于甲型流感病毒进化动态的深入了解可以提高我们对它的监测能力,并有可能预计其进化轨迹进而选择合适流感疫苗株。本研究对甲型流感病毒的进化研究具有科学意义,为更有效的流感疫苗研制和流感的防控策略提供了科学依据。