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研究背景:急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是危重病人常见的肺部疾病,常导致多器官功能障碍的发展,病死率高,预后差。尽管过去几十年中对ALI发病机制的研究取得了极大进展,但可用于有效干预ALI的临床疗法仍然有限,迄今为止尚无药物证明可有效治愈ALI。Ca2+是第二信使,广泛参与细胞增殖、肌肉收缩、酶调节等多种生理过程。细胞内Ca2+稳态平衡在维持肺上皮细胞完整性中起关键作用。细胞内Ca2+升高促进肺上皮细胞通透性的增加,从而引发ALI。铁死亡是非凋亡细胞死亡的一种形式,其特征在于细胞内铁和脂质过氧化的积累。铁死亡在肺损伤中发挥重要的调控作用,多项研究表明通过抑制铁死亡可以改善肺损伤,如何抑制铁死亡有可能成为ALI治疗的研究趋势。瞬时受体电位香草酸通道4（Tansient Receptor Potential Vanilloid 4,TRPV4）是非选择性钙渗透蛋白,在呼吸系统的内皮和上皮细胞中有功能性表达。既往研究发现TRPV4能通过在肺上皮细胞发挥作用影响肺水肿。此外,有研究证明细胞感受器TRPV4离子通道与铁死亡存在关系,然而TRPV4通道是否介导铁死亡调控ALI,及其调控机制目前尚不清楚。第一部分急性肺损伤小鼠中钙离子内流和铁死亡情况研究目的:探究ALI动物模型和细胞模型中Ca2+内流和肺上皮细胞铁死亡情况。研究方法:为探索急性肺损伤过程中细胞是否发生铁死亡,本实验构建了LPS诱导的ALI小鼠模型,通过HE染色检测小鼠肺组织的病理学变化,免疫荧光双染检测铁死亡标志物GPX4、SLC7A11分别与TRPV4的表达和共定位情况。选取人正常肺上皮细胞系BEAS-2B进行细胞实验,构建LPS诱导的ALI细胞模型,通过DCFH-DA活性氧检测试剂盒检测细胞质ROS,MDA含量检测试剂盒检测细胞脂质过氧化,Western Blot检测铁死亡标志物GPX4、SLC7A11和TRPV4的表达,钙离子浓度检测试剂盒检测细胞内钙离子浓度。研究结果:1.与对照组小鼠相比,LPS诱导的ALI小鼠肺组织出现明显的水肿、充血及大量炎性细胞浸润;且GPX4和SLC7A11表达比较弱,而TRPV4呈现高表达状态;TRPV4与GPX4、SLC7A11存在共定位表达。2.与对照组细胞相比,LPS诱导的ALI细胞模型中ROS和MDA含量明显增加;GPX4和SLC7A11蛋白水平明显下降;细胞活力显著降低,而铁死亡抑制剂Fer-1能逆转ALI细胞活力。3.与对照组细胞相比,LPS诱导的ALI细胞模型中TRPV4蛋白表达和细胞内Ca2+浓度增高。第二部分TRPV4调控肺上皮细胞中钙离子内流和铁死亡的分子机制研究目的:探究TRPV4介导钙离子内流和肺上皮细胞铁死亡调控ALI的分子机制。研究方法:本实验利用LPS诱导肺上皮细胞构建了ALI细胞模型。为了解TRPV4在ALI细胞模型中的作用,我们使用TRPV4拮抗剂（GSK2193874）、TRPV4激动剂（GSK1016790A）处理肺上皮细胞,研究TRPV4活性对Ca2+内流和肺上皮细胞铁死亡的影响。通过转录组测序筛选TRPV4下游靶基因,q PCR验证候选靶基因的表达。使用回复实验验证TRPV4通过靶基因介导Ca2+内流和肺上皮细胞铁死亡的分子机制。研究结果:1.与ALI组相比,抑制TRPV4的活性可阻碍ALI细胞模型中的Ca2+内流,减轻ALI诱导的肺上皮细胞铁死亡,而激活TRPV4则起相反的作用。2.在ALI细胞中,抑制TRPV4导致246个m RNAs表达发生改变,其中89个m RNAs上调,158个m RNAs下调。TRPV4调控的差异基因主要参与“激活跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性”、“HIF-1信号通路”、“内分泌因子调节钙重吸收”等信号通路。3.q PCR结果表明,与ALI组相比,COL1A2表达在ALI+GSK2193874组下调。4.与ALI组相比,TRPV4拮抗剂GSK2193874抑制Ca2+内流和肺上皮细胞铁死亡,而这种抑制性作用可被COL1A2过表达逆转。第三部分靶向抑制TRPV4和铁死亡对急性肺损伤的治疗作用研究目的:探究靶向TRPV4和抑制铁死亡对ALI动物模型的治疗作用。研究方法:本实验构建LPS诱导的ALI小鼠模型,分别使用TRPV4拮抗剂GSK2193874和铁死亡抑制剂Fer-1进行治疗,通过HE染色检测小鼠肺组织的病理学变化,肺干湿重量检测肺水肿情况,MDA含量检测试剂盒检测小鼠的MDA水平,Western Blot和IHC检测GPX4表达情况。研究结果:1.与对照组小鼠相比,ALI组小鼠肺组织结构损伤、肺泡出血、间质水肿和肺泡内水肿的程度更严重,而ALI+GSK2193874治疗组和ALI+Fer-1治疗组损伤程度较轻。2.与对照组相比,ALI组MDA水平最高,GPX4水平最低,而ALI+GSK2193874治疗组和ALI+Fer-1治疗组能有效缓解ALI中铁死亡的情况。结论:1.ALI小鼠模型和LPS诱导的ALI细胞模型中,细胞内Ca2+浓度升高,肺上皮细胞铁死亡增加。2.TRPV4蛋白表达在ALI中增高,抑制TRPV4的活性可阻碍Ca2+离子内流,减轻ALI诱导的肺上皮细胞铁死亡。3.TRPV4促进COL1A2的表达,且COL1A2过表达可逆转TRPV4对钙离子内流和肺上皮细胞铁死亡的调控作用。4.靶向抑制TRPV4可减轻ALI小鼠中的铁死亡,改善肺水肿。