论文部分内容阅读
辅助生殖技术(ART)尤其是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的开展和成熟是治疗不孕、不育症最为行之有效的手段。控制性超排卵是IVF-ET妊娠率逐步提高的原因之一,然而不同个体的卵巢对外源性促性腺激素(Gn)有不同的反应。卵巢低反应的发生率约为12%～30%,以超排卵后获卵数目少和血雌二醇(E2)峰值低为特征,常导致治疗周期取消和低妊娠率,甚至部分患者只能选择赠卵。因此如何评估和改善超排卵周期卵巢低反应是IVF工作中亟待解决的难题。生长分化因子-9(GDF-9)、GDF-9B作为卵源性生长因子近年来被发现可能是卵泡发育过程的关键调控因子,二者隶属转化生长因子-β (TGF-β)家族,通过自分泌及旁分泌方式作用于卵母细胞、颗粒细胞及卵泡膜细胞,调节卵巢局部细胞的分化、增殖,调控优势卵泡的形成及卵母细胞的成熟。研究GDF-9、GDF-9B表达与超排卵卵巢低反应的关系及调控机制,为临床改善卵巢功能、提高获卵率提供理论依据。第一部分GDF-9、GDF-9B表达与卵巢低反应的关系目的：研究超排卵周期GDF-9、GDF-9B表达与卵巢低反应的关系,探讨二者是否参与卵巢低反应的发生机制。方法：选取行IVF-ET的患者70例,采用常规长方案进行超排卵,依据取卵时获得平均直径>14mm的卵泡数分为卵巢低反应组21例,正常反应组25例,高反应组24例。应用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术检测卵巢不同反应组患者卵泡壁颗粒细胞和卵丘颗粒细胞GDF-9mRNA、GDF-9B mRNA的表达,分析GDF-9和GDF-9B与卵巢低反应的关系,以及二者与超排卵获卵数的相关性。结果：卵巢不同反应组患者年龄、不孕年限、基础FSH、E2、LH水平差异均无统计学意义(P>0.05)。卵巢低反应组卵泡壁颗粒细胞和卵丘颗粒细胞的GDF-9mRNA相对表达量低于正常反应组及高反应组,差异有统计学意义(P<0.05)。而GDF-9B mRNA在卵巢低反应组表达量最高。对超排卵获卵数目与卵泡壁颗粒细胞、卵丘颗粒细胞GDF-9、GDF-9B mRNA相对表达量作相关分析,GDF-9相对表达量与超排卵获卵数呈正相关,而GDF-9B相对表达量与获卵数呈负相关(r分别为0.685、0.648；-0.737、-0.601,均P<0.001)。第二部分人GDF-9基因真核表达及纯化目的：构建人GDF-9真核表达载体,在稳定转染的细胞系诱导表达,并纯化获得GDF-9重组蛋白。方法：以cDNA克隆为模板PCR法扩增人GDF-9基因,将所得基因片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/GDF-9;重组质粒以脂质体介导法转染人胚肾293T细胞诱导表达,免疫亲和层析法纯化目的蛋白。结果：阳性克隆质粒经酶切鉴定和测序结果证明pcDNA3.1(+)/GDF-9重组真核表达载体构建成功,Western blotting确证纯化重组GDF-9蛋白成功获得。第三部分重组蛋白GDF-9对小鼠超排卵的影响目的：通过体内动物模型观察重组蛋白GDF-9对小鼠超排卵的影响,深入分析GDF-9对卵泡发育的作用。方法：选取30只性成熟雌性KM小鼠随机分配为三组,每组10只。第1组对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水；第2组HMG组注射HMG10IU;第3组联合组注射HMG10IU联合重组蛋白GDF-910μg；48h后三组30只小鼠均予注射HCG10IU。注射HCG后16-20h处死小鼠,比较各组小鼠卵巢指数(卵巢重量／体重)及获卵数目,ELISA法检测血清雌二醇含量,并对卵母细胞进行体外受精观察各组受精情况。结果：HMG组、重组蛋白GDF-9联合HMG组获卵数、超排后卵巢指数、血清雌二醇含量均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),尤以联合组获卵数最多、卵巢指数最大、雌二醇含量最高；对照组、HMG组、联合组三组小鼠卵母细胞体外受精率相近,差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1GDF-9、GDF-9B在超排卵患者卵泡壁颗粒细胞和卵丘颗粒细胞均有表达,GDF-9表达水平降低、GDF-9B表达水平升高与超排卵周期卵巢低反应有关。GDF-9表达与超排卵获卵数呈正相关关系,GDF-9B表达与获卵数呈负相关关系。2.成功构建人GDF-9基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/GDF-9,并获得纯化重组GDF-9蛋白。3.重组蛋白GDF-9可以辅助Gn有效增加小鼠超排卵获卵数,提高卵巢反应性；重组蛋白GDF-9与Gn联合应用,对小鼠卵母细胞的正常受精能力无影响。