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蔗糖磷酸化酶（Sucrose phosphorylase,简称SPase）作为一种葡萄糖基转移酶,能够以蔗糖为供体、葡萄糖为受体,通过转苷反应制备曲二糖。曲二糖具有促进肠道益生菌生长、抑制α-葡萄糖苷酶活性及延缓碳水化合物消化吸收等功能,在食品和医药领域具有广泛应用潜力,通常采取SPase等合成曲二糖。然而,目前报道的SPase仅在大肠杆菌中异源表达,并不适用于食品工业应用,而枯草芽孢杆菌（B.subtilis）作为食品安全宿主则是表达SPase的更佳选择。本研究首次将青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）来源的蔗糖磷酸化酶在B.subtilis WS11中异源表达,研究了SPase作为一种天然胞内酶却被分泌至胞外的原因,并对其酶学性质进行研究。在此基础上,优化重组酶制备曲二糖的工艺。此外,采用多种固定化载体对SPase进行固定化,获得了较好的固定化效果。主要研究结果如下:（1）构建重组菌B.subtilis/pBSMuL3-SPase和B.subtilis/pHY300PLK-SPase,其中重组菌B.subtilis/pBSMuL3-SPase摇瓶发酵酶活更高,胞内酶活为0.56 U·mL-1。此外,还意外发现其胞外酶活高达1.58 U·mL-1,此胞外表达现象简化了酶液获取过程。进一步分析SPase高效分泌至胞外的原因,推测SPase是通过非典型分泌途径被分泌到胞外。（2）将酶液进行纯化,考察其酶学性质。结果表明重组酶的最适反应pH为7.5,最适温度为60℃,在60℃和55℃的半衰期分别为20 h和80 h,且有广泛的pH耐受性。（3）利用重组SPase催化合成曲二糖,在单因素优化的基础上,进行L9（33）正交试验。最终得到最佳工艺条件:加酶量为20 U·g底物-1,蔗糖/葡萄糖为0.5 M/0.5 M,pH 7.0,反应温度50℃,反应时间36 h,在此条件下生成曲二糖的转化率为40.01%,产量为104.45g·L-1,纯度为44.16%。为得到更高纯度的曲二糖,采用酿酒酵母处理产物除去可消化糖,最终得到纯度为95.14%的曲二糖。（4）采用壳聚糖-聚乙二醇、LX-1000EA、LX-1000HA三种载体对重组SPase进行固定化,其中LX-1000HA固定化SPase操作方便,固定化和应用效果好、成本低。在加酶量9 U·g载体-1、固定化时间为16 h时,LX-1000HA固定化SPase酶活回收率达到101.82%。酶学性质表明,其最适温度为55℃,最适pH为7.0。利用LX-1000HA固定化SPase连续反应8批次后,残留酶活为97.03%,且转化率仍保持在45.24%。上述实验结果表明,该固定化酶可有效促进曲二糖的合成,且具有良好的操作稳定性,从而为固化酶工业化连续生产曲二糖提供参考价值。