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研究背景: 多生牙在人类中具有一定发病率,且与许多综合征相关联,受基因和环境因素共同影响。牙齿发育是由外胚层来源的牙上皮和颅神经嵴细胞来源的间充质相互诱导、相互作用的结果,复杂的信号网络调控牙胚发育形态、结构、数目。Shh信号在牙胚发育早期起关键调控作用。 研究目的: 通过使用Hedgehog信号小分子抑制剂Vismodegib(GDC-0449)建立小鼠多生牙模型,研究Hedgehog信号在牙胚发育早期对牙齿数目的调控作用及与其他信号通路的联系,完善多生牙发生的机制,进一步探究牙列替换的原理。 研究方法: 1、对实验组ICR孕鼠分别在E9.5、E10.5、E11.5以150mg/kg单剂量灌胃Vismodegib,对照组灌胃等量溶剂,并在E16.5剖出胎鼠,通过HE染色观察有无多生牙及其他表型,确定诱导多生牙形成的关键时间点。 2、对实验组ICR孕鼠于E10.5天时以150mg/kg单剂量灌胃Vismodegib,对照组ICR孕鼠灌胃等量溶剂,分别于 E11.5、E12.5、E13.5、E14.5、E15.5、E16.5、E18.5剖出胎鼠,通过HE染色观察多生牙形成的动态过程及与对照组的形态差别。 3、实验组及对照组孕鼠分别于 E11.5、E12.5、E13.5剖取胎鼠,分离下颌进行早期牙上皮指标Pitx2原位杂交,观察多生牙初始形成的位置与第一磨牙的关系,以明确多生牙形成的机制。 4、实验组及对照组分别于E16.5剖取胎鼠,分离下颌磨牙区,移植入裸鼠肾被膜下,待两个月后取出移植块,观察形成矿化牙齿的数目及形态。 5、实验组及对照组分别取E11.5、E12.5、E13.5胎鼠进行β-catenin、Osr2、Bmp4免疫荧光检测,研究多生牙形成的分子机制。 研究结果: 1、实验组孕鼠于E9.5及E10.5灌胃150mg/kg Vismodegib均出现下颌第一磨牙舌侧多生牙、腭裂及下颌后缩,而 E11.5灌胃则仅出现腭裂表型,说明 E9.5及E10.5是诱导多生牙形成的关键时间点,在胚胎发育早期阻断Hedgehog信号通路会引起牙齿形态、数目的变化。 2、实验组孕鼠在E10.5灌胃150mg/kg Vismodegib后牙胚发育进程慢于对照组,在E13.5天时下颌第一磨牙胚舌侧出现一多生牙胚,与第一磨牙胚大小及形态无明显差异,多生牙与第一磨牙胚同步发育。 3、实验组E12.5胎鼠下颌磨牙胚范围较对照组大,E13.5出现四个明显的磨牙胚,近中端相连,远中端分开呈“人”字形。 4、实验组E16.5胎鼠一侧下颌磨牙区移植入裸鼠肾被膜下形成4颗矿化牙齿,对照组形成3颗。 5、免疫荧光结果显示E12.5、E13.5实验组β-catenin表达较对照组高,而Osr2及Bmp4对照组实验组表达无明显差异。 结论: 1、通过在胚胎发育早期使用Hedgehog信号通路抑制剂Vismodegib可诱导小鼠下颌第一磨牙舌侧形成多生牙,形态、大小与第一磨牙类似。 2、多生牙的形成可能与胚胎发育早期阻断 Hedgehog信号后 Wnt信号增强有关,多生牙与第一磨牙胚初始形成时可能由一个原始牙胚分裂而来。