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晕动症(motion sickness)是人体处在加速度运动环境下产生的以自主神经症状为主的多系统生理反应综合症。在人群中,晕动症具有明显的个体易感性差异,有研究发现基因的单核苷酸多态性可能是影响晕动症的易感性的一个重要遗传因素。前期通过基因表达谱筛选和动物实验,我们发现并验证了前庭核嗅觉受体Olr81(olfactory receptor 81)在晕动症易感大鼠前庭核表达升高,抑制晕动症易感大鼠前庭核Olr81高表达对动物的晕动症症状具有明显的缓解作用。通过人群试验,我们发现Olr81同源性受体OR52J3(olfactory receptor family 52 subfamily J member 3)胞内段C末端SNP rs57026471的C903T突变(蛋白序列301位精氨酸转变为终止密码子)与个体晕动症易感性相关。然而,前庭核表达的嗅觉受体Olr81(OR52J3)及其rs57026471突变体通过何种机制影响晕动症的易感性并不明确。基于前期研究结果,本研究进一步采用Pull-Down联合蛋白质质谱实验,结合生物信息学分析来筛选与Olr81受体突变位点所在的胞内段C末端具有特异性相互作用的结合蛋白;其次利用动物晕动症模型,明确前庭核Olr81下游与晕动症易感性相关的信号通路;最后,在细胞水平观察OR52J3(Olr81)及其突变体对NMDA受体膜表达的影响,通过动物实验观察抑制Olr81相互作用蛋白CK2活性对NMDA受体膜表达及晕动症易感性的影响,以初步探索CK2与OR52J3(Olr81)相互作用影响晕动症的易感性相关的可能途径。研究内容:1.Olr81 rs57026471突变对胞内段相互作用蛋白质组谱的影响(1)通过合成携带标签蛋白(His-)的受体胞内段C末端序列,利用Pull-Down联合LC-MS/MS质谱获取差异蛋白,结果进行非标定量分析;(2)通过差异蛋白筛选以及生物信息学分析进一步来锁定与Olr81受体突变位点所在的胞内段C末端存在特异性相互作用的结合蛋白。2.观察Olr81下游相关信号通路活性变化及对晕动症易感性的影响(1)通过条件性张口实验筛选出晕动症易感(MSS)和不易感(in MSS)SD大鼠,利用晕动症反应行为学(包括条件性张口、旷场探索、排便、平衡杆实验)变化观察动物尾侧前庭核Olr81表达变化对动物晕动症的易感性的影响;(2)利用Western Blot实验和免疫荧光双标记观察尾侧前庭核嗅觉受体Olr81表达变化对NMDA受体膜表达的影响;(3)第二信使水平和酶活性检测观察易感和不易感SD大鼠尾侧前庭核Olr81表达变化对下游第二信使水平和关键酶活性的表达水平的影响;(4)给予CK2抑制剂(CX4945)、NMDA受体抑制剂(MK801)、PKA抑制剂(H89 2Cl)观察抑制CK2、NMDA及PKA活性对不易感动物晕动症反应行为学的影响。3.CK2-Olr81相互作用及其对NMDA受体膜表达的影响(1)构建OR52J3(Olr81)及其rs57026471突变体细胞模型,通过Western Blot实验观察OR52J3(Olr81)及其rs57026471突变对NMDA受体膜表达的影响;(2)通过药理学实验,观察给予CK2抑制剂(CX4945)、PKA抑制剂(H89 2Cl)抑制CK2活性及OR52J3下游PKA信号通路对NMDA受体膜表达的影响;(3)通过免疫共沉淀实验明确OR52J3的rs57026471突变对OR52J3-CK2α、OR52J3-NMDA相互作用的影响。研究结果:1.Olr81 rs57026471突变对胞内段相互作用蛋白质组谱的影响(1)通过Pull-Down结合LC-MS/MS质谱分析最终鉴定出与Olr81胞内段C末端肽段能够发生相互作用的21573个肽段和2438个蛋白质;(2)通过质谱结果的差异蛋白筛选以及利用生物信息学分析,我们确定了13个候选差异蛋白。在进一步结合以往文献进行分析后,我们最终确定了酪蛋白激酶2(CK2)作为我们的候选蛋白。2.观察尾侧前庭核CK2-Olr81表达变化对晕动症的影响(1)经尾侧前庭核内注射p Ad-mi Olr81后,显著缓解了旋转刺激诱发的MSS大鼠条件性张口反应、平衡功能障碍,增加了自发活动总路程和活动频次;经尾侧前庭核内注射p Ad-Olr81后,显著加强了旋转刺激后in MSS大鼠的条件性张口反应、平衡功能障碍,降低了自发活动总路程和活动频次;(2)p Ad-mi Olr81处理能够降低MSS大鼠尾侧前庭核Olr81及NR2A膜蛋白表达水平,而p Ad-Olr81注射能够增加in MSS大鼠尾侧前庭核Olr81及NR2A膜蛋白表达水平;免疫荧光实验发现,尾侧前庭核内有大量Olr81及NR2A阳性神经元,其中晕动症易感组Olr81阳性神经元的数量比晕动症不易感组动物明显增多;(3)下调MSS大鼠尾侧前庭核Olr81表达水平能够显著降低AC和PKA活性以及c AMP水平,而上调in MSS大鼠尾侧前庭核Olr81表达水平显著增加了AC和PKA活性以及c AMP水平;(4)前庭核Olr81过表达加重了in MSS动物旋转刺激后的条件性张口反应、平衡功能障碍,显著降低了自发活动总路程和活动频次;CK2抑制剂(CX4945)干预后显著抑制了由于Olr81过表达引起的条件性张口反应、平衡功能障碍,并显著提高了自发活动总路程和活动频次;此外,抑制NMDA受体和PKA活性同样显著抑制了Olr81过表达引起的条件性张口反应、平衡功能障碍,并显著提高了自发活动总路程和活动频次。3.CK2-Olr81相互作用对NMDA受体膜表达的影响(1)OR52J3(Olr81)及其rs57026471突变体转染细胞后均可显著提高NMDA受体(NR2A、NR2B亚单位)总蛋白表达水平,并且与OR52J3(Olr81)相比,rs57026471突变体增加NMDA受体(NR2A、NR2B亚单位)总蛋白表达水平的作用更加显著;rs57026471突变体能显著增加NR2A膜表达水平;OR52J3及其rs57026471突变体转染细胞的NR2B膜蛋白/总蛋白比值均显著下降;(2)单独抑制CK2及同时抑制CK2、PKA时NR2A总蛋白水平显著下降,而单独抑制PKA无明显差异;单独抑制PKA、CK2及同时抑制CK2、PKA时NR2B总蛋白水平显著下降,NR2A及NR2B膜蛋白水平无显著差异;同时抑制CK2、PKA时NR2A及NR2B膜蛋白/总蛋白比值均显著升高,单独抑制CK2时NR2B膜蛋白/总蛋白比值同样升高;(3)OR52J3(Olr81)及rs57026471纯合突变体与CK2α及NR2A、NR2B亚单位均存在相互作用;两者与CK2α亚单位的相互作用无显著差异,但rs57026471纯合突变体与NR2A、NR2B亚单位的相互作用与OR52J3(Olr81)相比显著减弱。研究结论:1.CK2是Olr81受体突变位点所在的胞内段C端存在特异性相互作用的关键分子。2.尾侧前庭核Olr81通过CK2提高动物的晕动症易感性;Olr81表达增加导致晕动症易感性增高与Olr81下游AC/c AMP/PKA通路有关。3.Olr81突变能提高NMDA受体的表达水平;CK2与OR52J3(Olr81)及其rs57026471突变体的相互作用可能是调控NMDA受体膜亚基转换的重要途径。