当前药物靶点的筛选主要集中在细胞膜受体和代谢相关的酶类等。成纤维细胞生长因子受体（Fibroblast growth factor receptors,FGFRs）属于酪氨酸激酶家族成员之一,具有自身酪氨酸磷酸化活性,与其相应配体成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factors,FGFs）结合调节细胞增殖、分化、迁移和存活等。目前已发现4种FGFR,即FGFR1-4。骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）是关节软骨老化、变性和继发的软骨增生,骨化为主要病理变化,以关节僵硬、功能障碍为主要临床表现的一种慢性疾病,是严重影响人民生活质量、国家经济和社会发展的重大问题。药物治疗主要围绕缓解疼痛、抑制炎症等方面,如口服甾体类抗炎镇痛药;物理治疗主要对持续性的疼痛采取关节腔内注射透明质酸、类固醇激素与富含血小板的血浆等,但这些治疗难以从根本上缓解OA的进展。全关节置换是晚期OA患者仅有的有效治疗措施,但到此阶段,患者生活质量已长时间受到严重影响,且并发症多。因此,深入研究OA退变的机制,寻找和开发有效防治OA退变的药物与措施是我国当前健康领域重大的战略需求。课题组前期利用他莫昔芬可诱导关节软骨特异性敲除Fgfr1小鼠模型,通过分析3种关节炎模型(衰老模型、抗原诱导的关节炎模型（Antigen-induced arthritis,AIA）、创伤诱导的内侧半月板不稳定模型（Destabilization of the Medial Meniscus,DMM）的关节病理及量化评分,结果显示关节软骨细胞敲除Fgfr1能够延缓衰老模型、AIA模型导致的关节软骨基质蛋白多糖的丢失并减轻DMM模型导致的关节软骨结构破坏。同时发现拮抗FGFR1的小分子化合物GL-141可阻止DMM模型诱导的OA的病理发展,达到保护关节软骨的目的。上述研究结果提示靶向抑制FGFR1可能是缓解或治疗关节软骨损伤和退变的新策略。当前在全球范围内,肺癌依然是人类癌症致死的重要原因。统计分析发现大于90%的肺癌患者都有吸烟史或曾长期使用烟草制品。不过,诸如氡气,石棉,空气污染物暴露以及慢性感染之类的其它因素也在肺癌的形成中起到一定的作用。另外,人们也发现了多种遗传性及获得性易感机制。根据组织病理学特点肺癌主要分为两类,即小细胞型肺癌（Small-cell lung carcinomas,SCLC）和非小细胞型肺癌（Non small-cell lung carcinomas,NSCLC）。过去25年间对肺癌的诊断和治疗有一些进步,但肺癌患者的预后仍不乐观。目前标准治疗方案对肺癌的效果十分有限,仅对一些极为局限的肺癌有较好的效果。有研究表明FGF2和FGFR1在多数肿瘤中高表达,并且与某些肿瘤的分期、分级、转移和预后密切相关。FGF2可通过自分泌和旁分泌作用刺激肿瘤细胞,FGFR1和FGF2结合后发生自身酪氨酸磷酸化,激活下游信号通路,从而促进肿瘤细胞增殖,促进肿瘤血管发生,对肿瘤发展、转移和预后起重要作用。提示靶向抑制Fgfr1可能是治疗肿瘤的新策略。本课题以FGFR1为靶蛋白,通过噬菌体展示技术筛选与FGFR1特异结合的12肽,研究其在缓解或治疗OA和延缓肺癌发生发展中的作用。经过三轮“吸附-洗脱-扩增”淘选,得到3个与FGFR1特异结合的12肽序列。多肽与FGFR1结合,通过MAPK信号通路抑制FGFR1及下游ERK1/2信号。进一步在小鼠膝关节行DMM手术,关节腔注射多肽R1-P1的小鼠关节软骨退变和基质丢失程度显著性降低,提示R1-P1多肽可以缓解DMM模型导致的小鼠关节炎表型。另外,体外建立鸡胚绒毛尿囊膜模型和Tube模型,R1-P2多肽处理可抑制血管发生。进一步在裸鼠皮下注射A549细胞建立在体成瘤模型,腹腔注射R1-P2多肽可显著减小成瘤组织块的体积和质量,提示R1-P2多肽可通过抑制细胞增殖和血管发生抑制肺癌发展。因此,FGFR1特异结合多肽可能是调节FGFR1活性的新型抑制剂,为进一步研制用于治疗OA和肺癌的高靶向性药物奠定了实验基础。研究方法:第一部分:噬菌体展示技术筛选与FGFR1特异结合的多肽1.以FGFR1为靶蛋白,噬菌体展示技术筛选随机12肽。2.ELISA检测阳性单克隆与FGFR1的亲和力及与FGF2的竞争洗脱率。3.基于氨基酸序列分析12肽的基本物理化学性质（网址:http://www.expasy.org/tools/protparam.html）。第二部分:FGFR1特异结合多肽R1-P1缓解OA的进展1.ELISA和分子对接分析多肽R1-P1和FGFR1的亲和力。2.IL-β1处理人股骨头全层软骨组织块,番红O染色检测多肽R1-P1存在或不存在情况下胞外基质着色情况。3.qRT-PCR分析小鼠原代软骨细胞中多肽R1-P1对软骨稳态维持相关基因表达的影响。4.WB分析小鼠原代软骨细胞中多肽R1-P1对FGFR1及其下游信号的影响。5.8周小鼠膝关节行DMM手术,术后连续4,8,12周关节腔注射R1-P1肽,小鼠关节软骨损伤组织学评估参考关节炎研究学会推荐方法进行评分。6.IHC和TUNTL法检测术后连续8周关节腔注射R1-P1肽对胞外基质代谢相关蛋白表达及软骨细胞凋亡的影响。第三部分:FGFR1特异结合多肽R1-P2抑制肺癌进程1.ELISA和分子对接分析多肽R1-P2和FGFR1的亲和力。2.WB分析A549和NCI-H460细胞中多肽R1-P2对FGFR1及其下游信号的影响。3.MTT法、TUNEL法、细胞划痕法和Transwell小室法检测多肽R1-P2对A549和NCI-H460细胞增殖、凋亡、迁移能力和侵袭能力的影响。4.在体建立裸鼠成瘤模型,腹腔注射多肽R1-P2检测对裸鼠成瘤的影响。5.体外建立Tube模型和CAM模型,检测多肽R1-P2对血管发生的影响。实验结果:第一部分:噬菌体展示技术筛选到3个与FGFR1特异结合的多肽1.经过三轮“淘选”,得到23个阳性噬菌体单克隆,进行DNA测序分析,得到3个与FGFR1结合的多肽序列,分别命名为多肽R1-P1,R1-P2和R1-P3。2.3种噬菌体单克隆与FGFR1均具有较高亲和力,且FGF2对这三种噬菌体单克隆与FGFR1的结合具有竞争作用。3.多肽R1-P1相对分子质量为1462.65,分子式为C₆₈H₉₁N₁₉O₁₆S₁,不稳定系数为33.87,理论等电点为6.92,总平均亲水性为-1.350;多肽R1-P2相对分子质量为1388.50,分子式为C₆₃H₈₉N₁₇O₁₉,不稳定系数为25.22,理论等电点为6.74,总平均亲水性为-0.883;多肽R1-P3相对分子质量为1523.76,分子式为C₇₂H₁₀₆N₂₀O₁₇,不稳定系数为89,理论等电点为8.60,总平均亲水性为-1.483。第二部分:FGFR1新型抑制剂R1-P1多肽可缓解或治疗OA1.多肽与FGFR1形成FGFR1/R1-P1复合物,总体评分和C评分分别是7.87和5。另外,根据RMSD图,RMSD在70 ns后波动接近2.5 A,且R1-P1肽可通过氢键、静电和疏水相互作用稳定结合到FGFR1上。2.R1-P1肽与FGFR1有较高的结合OD₄₅₀值,但与FGFR2和FGFR3的结合OD₄₅₀值较低。随着R1-P1肽浓度增加到50和100 mM,与FGFR1的亲和力逐渐增强。另外,25和50 mM R1-P1多肽显著抑制FGF2激活的磷酸化ERK1/2活性。3.20 ng/ml IL-1β处理人股骨头软骨全层组织块,25和50 mM多肽R1-P1处理后能显著减少胞外基质丢失,并能显著减少释放到培养基中的GAG含量。4.IL-1β处理后,小鼠原代软骨细胞中基质分解代谢相关酶Adamts5和MMP13的mRNA表达水平显著增高,基质合成代谢相关基因Aggrecan和Col II的mRNA表达水平显著降低,多肽R1-P1处理后恢复胞外基质代谢相关基因稳态的维持。同时,R1-P1肽可降低小鼠原代关节软骨细胞MMP13的表达和增加Aggrecan的表达,并抑制FGFR1下游信号ERK1/2的磷酸化水平。5.DMM术后4周呈现OA样表型,软骨基质丢失和关节软骨破坏。DMM术后8周OA样表型更加显著。连续8,12周关节腔注射R1-P1肽可显著缓解DMM所致关节软骨基质丢失和关节软骨破坏。另外,H&E染色和滑膜组织学评分提示连续8,12周关节腔注射R1-P1肽可显著缓解DMM所致滑膜炎症。6.DMM术后8周关节软骨组织增加基质水解酶Adamts5和MMP13的表达,减少软骨细胞基质Aggrecan和Col II的合成,增加Col X阳性细胞比率和凋亡阳性细胞比率,连续8周关节腔注射R1-P1肽可显著缓解DMM所致关节软骨基质Aggrecan和Col II丢失和减少基质水解酶Adamts5和MMP13的表达,减少关节软骨组织Col X阳性细胞比率和凋亡阳性细胞比率。第三部分:FGFR1特异结合多肽R1-P2通过抑制细胞增殖和血管发生抑制肺癌进展1.多肽R1-P2分别以A、B链结合位点与FGFR1蛋白胞外段特异结合,且亲和力为1.538×10^-77 M。2.FGF2激活A549和NCI-H460细胞的FGFR1活性及其下游ERK1/2信号的磷酸化水平,多肽R1-P2处理后显著抑制FGFR1的磷酸化水平及ERK1/2的磷酸化水平。3.体外细胞实验中,多肽R1-P2抑制FGFR1活性,包括降低A549和NCI-H460细胞的增殖活性,促进凋亡,并降低迁移能力和侵袭能力。4.裸鼠皮下注射A549细胞有显著的肿瘤包块形成,腹腔连续注射R1-P2多肽28 d显著抑制肿瘤包块的质量和体积。5.多肽R1-P2抑制血管发生和降低肿瘤组织中α-SMA,SM22和CD31的表达。结论:1.噬菌体展示技术筛选得到3个与FGFR1有较高亲和力的12肽序列。2.关节腔局部注射多肽R1-P1可缓解DMM引起的小鼠关节软骨退变。3.腹腔注射多肽R1-P2可通过抑制细胞增殖和血管发生抑制肺癌进展。