人脐带间充质干细胞来源细胞外囊泡的制备及其对实验性肝纤维化治疗作用的研究

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肝纤维化是一种由于肝脏发生损伤和炎症反应导致的过度修复过程,往往伴随大多数肝病发生,严重可进展为肝硬化甚至肝癌。肝星状细胞作为肝纤维化发生的重要诱因,主要负责细胞外基质的产生,在正常肝脏中呈现静止状态,一旦肝纤维化发生时,肝星状细胞会转化为激活状态,在肝脏中形成瘢痕,导致肝脏结构发生改变。目前临床上对于肝纤维化的治疗尚未发现十分有针对性并且有效的方案,干细胞移植是目前临床实验中较为推崇的治疗方案,但是由于干细胞治疗方案尚不完备,其临床应用受到了很大的限制。基于我们的前期研究和文献支持,我们推测人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡(hUC-MSC-EVs)能够抑制肝星状细胞的激活和纤维的形成,从而发挥抑制肝纤维化的作用。本研究旨在探讨hUC-MSC-EVs的制备及其对实验性肝纤维化的治疗作用。本文的主要研究内容与结果如下:(1)hUC-MSC-EVs制备与表征通过收集人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)培养基上清液,利用超高速离心方法,分离得到纯化的细胞外囊泡,通过对hUC-MSCs的结构、粒径和表面标志物三个参数进行表征,提取得到的细胞外囊泡符合文献报道特征。(2)hUC-MSC-EVs对活化LX-2细胞模型的代谢和凋亡的影响在细胞水平上,利用TGF-β1刺激LX-2细胞构建了人肝星状细胞系LX-2活化模型。利用超高分辨显微镜SIM观察线粒体形态,并利用流式标记JC-1分析线粒体膜电位变化,利用超高分辨显微镜SIM分析细胞内脂质含量。使用CCK-8、流式标记Annexin V-PI和2’,7’-二氯双氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)分别检测细胞增殖、凋亡和活性氧产生的情况。通过Western blot验证细胞外囊泡对活化的LX-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响。实验结果表明,hUC-MSC-EVs能够诱导活化的LX-2细胞中线粒体损伤,促进LX-2细胞发生氧化应激和凋亡,从而缓解肝纤维化。(3)hUC-MSC-EVs对细胞外基质合成和分泌的影响和其对TGF-β/SMAD信号通路的作用以及对大鼠肝纤维化模型的作用用比色法测定细胞中羟脯氨酸的含量,用ELISA测定培养上清中人Ⅰ型胶原α1((Col-Iα1)的含量;通过Western blot检测纤维化相关蛋白α-SMA、Col-I、TIMP-1、MMP-1 的表达以及 TGF-β/SMAD 信号通路中 TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4的蛋白表达;用CCl4诱导制备大鼠肝纤维化模型,测定hUC-MSC-EVs对大鼠肝功能的影响,并通过染色观察肝脏形态和胶原含量。结果显示,hUC-MSC-EVs能够抑制胶原合成相关蛋白的表达,调节细胞外基质合成相关酶,从而抑制细胞外基质的合成并促进降解;研究发现hUC-MSC-EVs通过调节TGF-β/SMAD信号通路,发挥抑制肝纤维化的作用;体内试验证明hUC-MSC-EVs能够减轻大鼠的肝纤维化。尽管目前尚无针对治疗肝纤维化的最佳疗法,但本研究发现hUC-MSC-EVs治疗可能作为一种新的抑制纤维化的方式应用于抑制肝星状细胞活化和肝纤维化的治疗,具有良好前景。本论文的创新点包括:(1)本研究证实hUC-MSC-EVs对肝纤维化中活化的肝星状细胞有抑制作用,并且能够有效缓解大鼠肝脏纤维化。(2)研究发现hUC-MSC-EVs的治疗能够对肝星状细胞的线粒体造成损伤,抑制氧化应激反应,从而抑制肝星状细胞的代谢,同时促进肝星状细胞的凋亡。(3)研究证明hUC-MSC-EVs能够抑制肝星状细胞细胞外基质的合成和分泌。(4)研究发现hUC-MSC-EVs对肝纤维化的抑制作用是通过TGF-β/SMAD信号通路实现的。
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