磁性壳聚糖微球的制备及其对血管紧张素转化酶抑制肽的吸附研究

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血管紧张素转化酶抑制肽是可以通过抑制血管紧张素转换酶活性而达到降血压的作用的功能性活性肽。天然产物中直接酶解提取分离纯化血管紧张素转化酶抑制肽是一个十分繁琐耗时的过程。本文中,以化学性能良好的磁性壳聚糖微球作为亲和吸附载体,固定化铜离子作为亲和配基,以α-乳清蛋白水解体系中的血管紧张素转化酶抑制肽缬氨酰-丝氨酰-亮氨酰-脯氨酰-谷氨酰-色氨酸(VSLPEW)为模型分子,研究了三种不同粒径的固定化磁性壳聚糖微球亲和介质对VSLPEW分子的亲和吸附效果,为血管紧张素转化酶抑制肽的分离纯化技术提供了一定的理论依据。采用乳化交联法制备了小(纳米级S型)、中(微米级M型)和大(微米级L型)三种粒径的磁性壳聚糖微球,并确定S型-磁性壳聚糖微球的最优制备工艺条件为:壳聚糖与四氧化三铁纳米颗粒质量比为1:1.5,戊二醛用量为1mL,搅拌速率为S00r·min-1,反应时间为4h。经过粒径分析可以得出,S型-磁性壳聚糖微球的平均粒径为283nm,M型-磁性壳聚糖微球的平均粒径为1.3μm,L型-磁性壳聚糖微球的平均粒径为15μm。对三种磁性壳聚糖的形貌和性能进行了表征,发现三种磁性壳聚糖微球均呈超顺磁性,磁响应性良好,Fe304含量分别为39.8%,29.6%,40.6%,磁饱和强度分别为31.35emu·g-1,25.50emu·g-1,42.06emu·g-1。为确定S型-磁性壳聚糖微球经环氧氯丙烷活化后表面的环氧基密度,考察了不同的活化条件的影响,并在此条件下对三种不同粒径的磁性壳聚糖微球进行表面活化,最终确定最优活化条件为:活化温度为40℃,环氧氯丙烷体积分数为50%,活化时间为4h,NaOH溶液浓度为0.5mol·L-1。此时,三种磁性壳聚糖微球表面环氧基密度分别为251.51μmol·g-1,275.83μmol·g-,294.53μmol·g-1。使用亚氨基二乙酸(IDA)修饰环氧基活化后的磁性壳聚糖微球,考察不同因素对了S型-磁性壳聚糖微球表面螯合金属离子配基密度的影响,得到最优工艺条件如下:IDA加入量为0.1g,反应时间为8h,反应温度为40℃。在此最优工艺条件下,三种磁性壳聚糖微球表面Cu2+配基密度可达211.03μmol·g-1.236.63μmol·g-1和271.51μmol·g-1。以乳源中发现的ACE抑制肽VSLPEW为模型分子,考察了三种固定化铜离子磁性壳聚糖微球亲和介质对的亲和吸附效果,优化了磁性亲和介质对VSLPEW的亲和吸附条件,结果如下:VSLPEW的初始浓度为2.0mg·mL-1,吸附时间为40min,吸附温度为30℃,缓冲液pH值为7.5,在此条件下三种磁性亲和介质对VSLPEW的吸附量分别可达36.38mg·g-1,51.28mg·g-1,58.56mg·g-1。同时还研究了磁性亲和介质对VSLPEW的吸附模型。结果表明:VSLPEW在磁性亲和介质上的吸附行为符合Langmuir模型描述;磁性亲和介质对VSLPEW的吸附动力学性能符合伪二级动力学模型。最后,考察了L型-磁性壳聚糖微球亲和介质在牛血清白蛋白(BSA)与VSLPEW混合体系中对VSLPEW的吸附效果,结果表明,BSA与VSLPEW的混合体系中磁性亲和介质对VSLPEW、分子的吸附效果受到杂质大分子的干扰,对模型分子吸附量随其浓度降低而降低,说明在实际应用中应考虑到杂质分子对固定化亲和介质的干扰作用。
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