目的：瘢痕形成是创面愈合的必然结果，但瘢痕增生过度瘢痕挛缩，常常导致各种畸形功能障碍，给患者带来身心痛苦。多年来，瘢痕增生一直无确切的治疗方法。基因治疗是分子生物学的主要应用领域之一，理论上可以从根本上阻止许多疾病的发生与进展，并有望达到治愈的目的。基因治疗在肿瘤等疾病的防治研究中一直是研究的热点，但如何选择靶基因及靶细胞成为其关键。越来越多的实验证实细胞周期调节蛋白p27对许多肿瘤有抑制作用，因此p27又被称为抑癌基因，是肿瘤抑制性治疗的重要候选者，但其在瘢痕增生过程中的作用尚不清楚。本实验用Western Blot检测增生性瘢痕与正常皮肤组织p27蛋白的表达差异，提示p27可能与瘢痕形成有关；然后以体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblast，HTsFb)为靶细胞，以抑癌基因p27为目的基因，将构建的pcDNA3-p27真核表达质粒体外转染HTsFb，观察抑癌基因p27对HTsFb的生物学作用，为开展瘢痕的基因治疗提供实验和理论依据。 方法：1．用WesternBlot检测增生性瘢痕与正常皮肤组织p27蛋白的表达；2．．PCR法从含有p27全长的质粒中合成p27 cDNA片段，连接酶连接至pUC19质粒进行测序，证明PCR产物序列完全正确，限制性内切酶HindⅢ与EcoRI酶切pUC19-P27,获得p27 cDNA片段，连接酶连接至pcDNA3，克隆出真核表达质粒；3．利用脂质体介导的基因导入法将pcDNA3-p27导入HTsFb用Western Blot与免疫组化检测细胞转染后p27蛋白的表达情况；4．检测p27对HTsFb的生物学效应：①采用MTT、~3H-TdR掺入法观察p27对HTsFb增殖与DNA合成的影响；②用流式细 第四军医大学博士论文一胞仪检测p27对HTSFb的细胞周期的影响；③末端脱氧核昔酸转移酶介导的 dUTP切口末端标记（Terminal deoxynucleotibyl transferase （TdT）＊ediated dUTP nick end labelins，TUNEL）法观察 p27对HTSFb凋亡的影响；④用原位杂交法观察p27对HTSFb胶原合成的影响；⑤用成纤维细胞－胶原网（Fibroblast collagen co血action l扣ice）收缩模型观察了p27对HTSFb胶原网收缩的影响；③用透射电镜观察p27基因转染对HTsFb的超微结构的变化。 结果：1．增生性疲痕P27蛋白含量明显低于正常皮肤组织，提示P27可能与疲痕形成有关；2．成功构建了p27真核表达载体pCDNA3中27；3．pCDNA3个27成功转染HTSFb，并检测到p27蛋白的稳定表达；4．①p7对＊nFb增殖与＊＊A合成有明显的抑制作用： ②p27使 HTSFb S期细胞比例明显降低，GO凡 期细胞比例升高； ③原位检测法观察p27能促进HTSFb凋亡； ④用原位杂交法观察p27能抑制HTSFb合成胶原； ⑤p27在早期能促进HTSFb胶原网的收缩影响，后期作用相反； ③电镜观察显示pZ 7使HTSFb的超微结构呈现生长抑制特征。 结论：在成功构建p27真核表达载体pCDNA3个27的基础上，将其转染HTSFb并得到稳定表达；初步证实p27可能通过抑制的HTSFb增殖及DNA合成，干扰HTsFb的细胞增殖周期，抑制HTsFb的胶原合成等途径来抑制撅痕增生，为临床应用p27基因治疗瘟痕增生提供了实验 依据。