1.肿瘤转移相关基因cDNA微阵列技术平台的建立 (1) cDNA微阵列制备过程的优化和选择 cDNA微阵列技术是生物芯片领域应用于基因表达分析的基因芯片之一,随着人类基因组计划计划的完成和大量的共用数据库的建立使我们能够快速的掌握基因的信息。我们根据已有的单基因研究结果,查找了与肿瘤的发生发展密切相关的基因,同时根据已发表的肿瘤细胞与非肿瘤细胞的差异表达基因,根据基因名称和NCBI提供的Genebank的基因序列号,查找IMAGE克隆ID,然后从Research Genetics(目前已被Invitrogen收购)购买克隆。所查找的基因包括癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体、信号传导有关的分子、蛋白质合成有关的分子及ESTS等,构建了肿瘤转移相关基因cDNA克隆库。然后运用这个克隆库作为制备芯片的靶基因,对靶基因的质粒提取、以载体特异性的共有M13通用引物扩增靶基因的条件、靶基因的纯化、点样液的选择、点样靶基因的紫外交联固定、基片的选择进行了一系列的优化,发现以德国的Edge Biosystem 96孔板质粒提取试剂盒提取质粒、M13通用引物PCR扩增目的基因,以醋酸钠沉淀法纯化PCR产物、Arrayit spot solution作为点样介质、自行包被的多聚赖氨酸玻片和Cel Associate的氨基玻片均能取得良好的杂交效果。 (2) 逆转录标记方法的选择和条件优化 在目前所用的逆转录cDNA第一链的标记方法中,首先比较了相对经济快速的直接方法和间接方法,证明间接aadUTP标记方法明显优于直接荧光标记方法,并对间接标记方法的一系列环节,进行了筛选优化,包括RNA的提取试剂的选择、逆转录采用的引物的选择、逆转录的时间、逆转录所采用的RNA的量、偶联反应的中止试剂均进行了比较,对杂交温度和洗涤的条件均进行了优化。发现采用的三个厂家的Trizol提取的RNA均能满足要求,逆转录采用random hexamer、逆转录过夜、以0.1M醋酸钠中止偶联反应、42℃杂交过夜杂交的信号强,信噪比高,荧光背景低,获得的结果可靠。 (3) 芯片基因注解的建立、定量分析及校对方法的比较 通过相应的软件建立了肿瘤转移相关基因的基因注解,使芯片基因的杂交结果与基因信息偶联起来,便于进行进一步的分析和提交公共数据库,建立了定量分析的方法,并通过比较发现三种校对方法获得了高度一致的结果,在管家基因也发生改变时,建议使用total或Median校对方法。