骨肉瘤是儿童及青少年最常见的原发恶性骨肿瘤，侵袭性强，预后差。尤其好发于18周岁以下的学生。业已证实，骨肉瘤起源于骨间叶组织，肿瘤细胞形态大部分呈梭状，并能够分泌大量骨样基质，大部分病人患者初期以骨痛，局部肢体肿胀为主要临床表现，另见少部分患者因病理性骨折而入院检查发现肿瘤病变而确诊。流行病学资料显示，骨肉瘤的发病部位以长骨两端及干垢端为主，给予患者病变肢体行放射线检查见发病部位溶骨性破坏即可高度怀疑本病的发生。骨肉瘤的发病存在明显的地区差异，如美国每年新发病例约1千例左右，而我国为骨肉瘤高发地区，大约每年有近1万例新发骨肉瘤患者。令人鼓舞的是，随着手术方式及新辅助化疗技术的不断发展与进步，我国骨肉瘤患者的5年总生存率逐步提高到50％～58％之间，但仍然显著低于欧美国家的五年生存率(65％～75％)。得益于治疗方式的不断完善与优化，基于术前新辅助化疗+手术根治+术后多期化疗的完美结合，骨肉瘤化疗技术的不断发展尤其是新辅助化疗技术的应用推广，使得骨肉瘤患者的临床预后大为改善。骨肉瘤术后局部复发率约为16％～19％。对于某些不能彻底手术切除的病例，化疗的意义是非常重大的，然而，就目前现有治疗药物而言，远远不能满足临床抗肿瘤需求，尤其是常规化疗药物只对一小部分骨肉瘤患者有效。目前科研人员对骨肉瘤的研究主要集中予如何克服肿瘤细胞耐药性、最大程度的减少化疗毒性作用等方面，争取能在保证较为理想的抗肿瘤效应下，结合患者的临床预后因素，制定切实有效的个体化化疗方案，并通过给予新型治疗药物、改进药物组合、给药剂量、给药顺序和途径等方法，改善骨肉瘤患者的预后。　　回顾性研究提示，二型糖尿病药物二甲双胍可以在一定程度上降低糖尿病患者罹患各种恶性肿瘤的几率，抑或提高肿瘤患者术后的五年生存率和无瘤生存率，显著改善患者预后，提高其术后生存质量，降低肿瘤复发率。基于国内外多项回顾性研究，大量关于二甲双胍抗肿瘤的基础研究也逐渐被报道，如国外学者报道服用二甲双胍药物能够预防HCC的发生，甚至可以作为辅助药物用于HCC的治疗和干预，为了更加充分的证实二甲双胍对肿瘤的体内作用，该研究建立荷瘤小鼠模型，通过给予小鼠正常饮食或者添加二甲双胍饮食，分别比较两组小鼠发生HCC的几率，结果证实辅助二甲双胍饮食的小鼠组发生HCC的几率下降了近60％，且二甲双胍组小鼠肿瘤的体积也显著低于对照组。亦有文献证实二甲双胍与降脂药物合用可以降低HBC感染患者发生原发性肝癌的概率，此项研究认为单用二甲双胍可以下降乙肝患者转化为肝癌的几率，但二甲双胍辅助治疗暨联合降脂药物能够更大程度的保护慢性乙肝患者不转变为肝癌，同时该文章指出二甲双胍在安全范围内的剂量越大，这种对乙肝患者的保护作用越明显。此外，二甲双胍对体外培养的肺腺癌、结肠癌、乳腺癌及各种妇科肿瘤细胞等均有抑制作用，其抗肿瘤机制主要包括，影响AMPK信号通路的表达，特异性的降低肿瘤干细胞的细胞活性，引起细胞凋亡的发生，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，甚至引起细胞自噬的发生、抑制肿瘤上皮间质转化及肿瘤细胞侵袭转移等。经查阅国内外的文献资料，二甲双胍抗骨肉瘤的研究也有多项报道，如研究人员证实二甲双胍可以显著抑制骨肉瘤MG63的细胞增殖，且可以显著抑制MG63细胞内p-Akt及叉头框转录因子O亚族1(FoxO1)的表达水平，提示二甲双胍在体外对骨肉瘤MG63细胞增殖的抑制作用，可能与其对PI3K/Akt信号通路的阻断密切相关。国内学者等运用四甲基偶氮唑蓝比色法检测经过二甲双胍作用后的骨肉瘤细胞的细胞存活率，证实在体外培养的细胞中，二甲双胍可以显著影响对数期生长的骨肉瘤细胞的生长繁殖，进一步机制研究证实二甲双胍能够利用阻滞MG63骨肉瘤细胞周期于G2期来发挥抗肿瘤活性。此外，二甲双胍被报道可破坏骨肉瘤干细胞的形态，诱导骨肉瘤干细胞其发生凋亡，并对骨肉瘤细胞分化能力具有一定抑制作用，探讨其机制可能与二甲双胍能够激活AMPK及下调NANOG、OCT4蛋白的表达相关。此外，也有学者报道二甲双胍能够增强骨肉瘤细胞对传统化疗药物阿霉素的敏感性，为二甲双胍在抗骨肉瘤领域中的应用提供了另外一种可能。　　研究目的:　　1.探讨二甲双胍在体外单用或者联合顺铂对人骨肉瘤细胞生长增殖和细胞凋亡的影响，分析其对细胞周期调节蛋白及凋亡相关通路影响，初步分析线粒体介导的细胞凋亡通路在二甲双胍抗骨肉瘤细胞增殖过程中的作用机制。　　2.分析动物体内二甲双胍对裸鼠荷骨肉瘤细胞生长增殖和脏器转移的影响，并检测体内二甲双胍对骨肉瘤细胞凋亡相关通路蛋白表达的影响。　　3.通过上述系列体内与体外研究，能够明确安全范围剂量的二甲双胍对体内外培养的人骨肉瘤细胞生长增殖的影响，为二甲双胍在骨肉瘤治疗领域的应用提供新的理论依据。　　研究方法:　　1.体外培养人骨肉瘤细胞系U2OS及143B，采用MTT法检测二甲双胍在不同浓度梯度和不同时间点单用或者联合顺铂对于上述两种骨肉瘤细胞生长增殖的影响;　　2.两种骨肉瘤细胞分别经10 mM二甲双胍处理后48 h后，采用Hoechst33342染色经荧光显微镜观察其对细胞凋亡的形态学变化。Annexin V/PI双染经流式细胞仪检测相结合的方法检测不同浓度二甲双胍对上述两种骨肉瘤细胞凋亡及细胞周期运转的影响;　　3.Western blot法检二甲双胍对骨肉瘤细胞凋亡通路相关蛋白Bcl-2，Bcl-x1，Bax和PARP等表达和线粒体Cyt C释放的影响。　　4.体内实验部分，我们建立裸鼠荷骨肉瘤动物模型，单独应用二甲双胍或二甲双胍与化疗药物顺铂联合应用治疗裸鼠，观察二甲双胍单用或者联合顺铂对骨肉瘤细胞在体内增殖的影响，分析二甲双胍是否具有增强骨肉瘤细胞对顺铂敏感性的作用，并利用Western blot法检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白的影响。　　研究结果:　　1.MTT法结果显示:用不同浓度(0，5，10，20，50 mM)二甲双胍分别处理骨肉瘤细胞U2OS/143B不同时间点(24、48、72h)后，二甲双胍可以显著抑制两种细胞系的生长增殖，且这种抑制作用具有一定的浓度依赖性和时间依赖性，以143B细胞系为例，50 mM浓度的二甲双胍分别作用于该细胞24、48及72 h以后，细胞存活率分别为45.73％，35.16％及28.42％，组间比较差异有统计学意义(p＜0.05);此外，二甲双胍联合应用不同浓度顺铂组对骨肉瘤细胞的抑制作用更加显著，与单用二甲双胍组比较，差异分别具有统计学意义(p＜0.05)。　　2.二甲双胍诱导人骨肉瘤U2OS/143B细胞凋亡的形态学研究:经Hoechst33342染色后，对照组U2OS/143B细胞在荧光显微镜下呈均匀微弱蓝色荧光，而二甲双胍(10 mM，48 h)处理组的细胞呈现出明显强于对照组的颗粒状蓝色荧光，可见核皱缩、核碎裂、染色质边集且可见凋亡小体的存在。　　3.流式细胞术检测结果为:随着药物处理浓度的提高，U2OS细胞周期中处于S期的细胞逐渐增多，而143B细胞周期中处于G0/G1期的细胞逐渐增多。此外，二甲双胍可以诱导细胞凋亡，且随着药物浓度的增加，凋亡率越高。分别以10，20 mM浓度二甲双胍分别处理两种细胞系时，U2OS细胞的凋亡率分别为21.86％，30.31％，与对照组(1.20％)比较，差异分别具有统计学意义(p＜0.01);143B细胞的凋亡率分别为17.50％，26.18％，与对照组凋亡率(1.10％)比较，差异分别具有统计学意义(p＜0.01)。　　4.Westem blot法结果显示:二甲双胍干预骨肉瘤细胞48 h后，与对照组比较，抑凋亡分子Bcl-2、Bcl-x1蛋白表达下调，促凋亡分子Bax蛋白表达显著升高，而且处于凋亡信号通路下游的PARP则表现出明显的剪切化激活。此外，随着二甲双胍作用浓度的提高，线粒体中Cyt C也逐渐释放到细胞浆中。　　5.二甲双胍单用或者联合应用顺铂均可以在裸鼠体内抑制143B细胞的增殖生长，不同的治疗方式处理后，对照组、单用二甲双胍组及顺铂联合应用二甲双胍组肿瘤的体积分别为:795.6±27.3 mm3，743.6±41.7 mm3及261.9±30.7 mm3;单用二甲双胍组与二甲双胍联合应用顺铂组对裸鼠瘤体的抑制率分别6.54％，67.1％，单用二甲双胍可以抑制裸鼠体内肿瘤的增殖，但与对照组比较差异无统计学意义(p=0.08);有效剂量的二甲双胍联合顺铂可以在裸鼠体内抑制人骨肉瘤细胞系143B细胞的生长增殖，与对照组或者单用顺铂组比较，差异有统计学意义(p＜0.05)。未能观察到二甲双胍组可以有效抑制其脏器转移的发生。　　研究结论:　　二甲双胍可以体内外显著抑制骨肉瘤细胞的增殖，阻滞细胞周期运行，且诱导骨肉瘤细胞发生凋亡，此外，体内外联合应用二甲双胍可以增强骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性;Western Blot法进行骨肉瘤细胞全蛋白分析提示，二甲双胍主要是通过线粒体介导的细胞凋亡通路来诱导人骨肉瘤细胞U2OS和143B细胞发生凋亡的。