目的后纵韧带骨化（ossification of the posterior longitudinal ligament,OPLL）是一种多见于东亚国家的脊柱韧带异位骨化的疾病。OPLL在日本高发,患病率约为1.9%-4.3%,中国人的患病率约为3.08%,而在北美和欧洲患病率较低,约为0.1%-1.7%。OPLL好发于颈椎,约占70%,其次可见于胸椎和腰椎,并且男性较女性高发。OPLL的进展会占据椎管容积,导致脊髓、神经根压迫,损伤神经纤维和神经元细胞,从而产生四肢瘫痪、运动感觉障碍、括约肌功能障碍等临床表现,严重降低患者生活质量。OPLL具有家族聚集性发病的特点,饮食、肥胖、韧带应力、年龄、糖尿病等因素也会促使疾病发生,因此较多学者认为遗传因素与环境因素的共同作用导致OPLL发生。近年来出现大量有关OPLL易感基因的研究,尤其是单核苷酸多态性（SNPs）的筛选。这些研究一定程度证明遗传因素在OPLL发生发展中起到至关重要的作用,但尚无研究完整阐明OPLL发生的具体分子机制。研究表明,胞外微环境在维持成骨、破骨平衡中具有重要作用。因此,我们从该角度出发,探索微环境成分改变对后纵韧带组织中间充质干细胞（MSC）是否具有促进成骨分化的作用。外泌体是微环境中有效的调控成分和潜在生物学标志物,具有较强的生物活性。几乎所有体细胞均能通过胞吐作用向微环境中分泌外泌体,发挥细胞间信号传递的作用。尤其是外泌体携带微小RNA（mi RNA,mi R）进入靶细胞后,可介导心血管疾病、血液系统疾病、糖尿病、肿瘤等多种疾病的发生发展。现有研究也证明外泌体mi RNAs具有调控骨形成、骨破坏的作用,这些mi RNAs的异常表达和成骨、破骨性疾病密切相关。因此,我们针对外泌体mi RNAs进行研究,阐明其调控MSCs成骨分化的分子机制,以期为OPLL机制研究和未来药物研发提供一定参考依据。方法第一部分:（1）培养原代OPLL细胞和正常后纵韧带细胞,梯度离心法分离提纯细胞培养上清中的外泌体;（2）利用透射电镜扫描、粒径大小检测、表面标记物检测等手段验证收集到的微囊泡为外泌体;（3）提取外泌体总RNA进行高通量测序,筛选差异表达mi RNAs;（4）通过GO和KEGG富集分析,初步探索差异表达mi RNAs介导OPLL的生物学过程。第二部分:（1）利用亲脂性膜染色试剂PKH67将外泌体标记绿色荧光,观察外泌体是否携带mi R-140-5p进入MSCs;（2）慢病毒转染OPLL细胞,构建过表达或敲低mi R-140-5p的外泌体;（3）用不同mi R-140-5p丰度的外泌体干预MSCs的成骨诱导培养体系,探索外泌体mi R-140-5p对MSCs成骨分化的作用;（4）裸鼠皮下植入骨生长支架及细胞混合物,探索外泌体mi R-140-5p在体内对MSCs成骨分化的作用;（5）Micro-CT扫描并分析体内骨化物;（6）免疫组化检测并分析骨化物中成骨相关基因表达情况。第三部分:（1）数据库预测mi R-140-5p作用靶点,荧光素酶报告实验验证靶点并明确结合位点;（2）不同mi R-140-5p丰度的外泌体、mi R-140-5p模拟物（mimic）、mi R-140-5p抑制物（inhibitor）干预MSCs,检测靶点IGF1R表达情况;（3）通过过表达和敲低IGF1R的方法,探索IGF1R调控MSCs的作用;（4）通过逐一阻断信号通路并检测目标基因表达情况的方法明确各关键蛋白的上下游关系,阐明IGF1R调控MSCs成骨分化的分子机制。结果第一部分:成功培养原代OPLL细胞和PLL细胞后,分离收集得到的胞外微囊泡具有外泌体特征:透射电镜下呈现双脂质层凹陷圆盘样典型结构;纳米颗粒跟踪分析仪显示囊泡直径分布符合外泌体50-150 nm的定义;WB结果表明胞外囊泡表达外泌体标记蛋白CD63、TSG101。高通量测序筛选差异表达mi RNAs并经q PCR验证后表明,OPLL细胞来源外泌体中mi R-140-5p呈现最为显著的下调。GO与KEGG富集分析显示差异表达mi RNAs靶基因可能通过细胞过程、胞膜、结合、信号转换、翻译调控等生物过程、细胞组分或分子功能三大层面发挥调控作用。第二部分:外泌体示踪实验显示外泌体携带mi R-140-5p被MSCs摄取。过表达mi R-140-5p外泌体干预MSCs的成骨诱导后,碱性磷酸酶和茜素红染色明显受抑制,成骨相关基因表达被下调;敲低mi R-140-5p外泌体则促进MSCs成骨分化。外泌体mi R-140-5p在裸鼠体内具有抑制皮下异位骨化物形成的作用,骨化物的骨密度、骨量,以及成骨相关基因的免疫组化检测均表明成骨受到抑制。第三部分:荧光素酶报告实验明确了mi R-140-5p与IGF1R之间存在靶向结合的调控关系,以及二者序列中相互配对结合的片段。给予MSCs过表达mi R-140-5p外泌体或mi R-140-5p mimic后能引起MSCs内IGF1R下调,给予MSCs敲低mi R-140-5p外泌体或mi R-140-5p inhibitor后能引起MSCs内IGF1R上调,证明IGF1R是mi R-140-5p的直接靶点。过表达MSCs中IGF1R可促进MSCs成骨分化,敲低MSCs中IGF1R可抑制MSCs成骨分化,证明IGF1R对MSCs成骨分化具有重要的调控作用。IGF1R通过IRS1/PI3K/Akt信号轴调控m TOR通路并最终介导MSCs成骨分化启动的异位成骨过程。结论我们通过实验证明了OPLL发病的可能机制:mi R-140-5p在被外泌体转运入MSCs后,靶向结合IGF1R,通过IRS1/PI3K/Akt信号轴阻断m TOR通路,抑制MSCs成骨分化。但具OPLL患者的后纵韧带有骨化倾向,这些异常的后纵韧带细胞向周围微环境中分泌缺乏mi R-140-5p的外泌体,这些致病性外泌体被MSCs摄取后,成骨抑制作用减弱,相对地刺激MSCs成骨分化,最终形成了异位骨化物。