研究背景上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer,EOC）是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,其起病隐匿、进展快、多数患者初诊时已属疾病晚期。晚期EOC采用肿瘤细胞减灭术和铂类药物为基础的联合化疗,但对铂类药物的原发性或获得性耐药导致了 70%～80%的EOC患者肿瘤复发。晚期EOC患者的5年生存率仅为30%左右。尽管诊疗手段不断进步,EOC患者的预后并未得到明显改善;因此,深入探讨卵巢癌铂类耐药的分子机制,发掘影响EOC患者预后的关键分子靶点,为EOC的防治提供新的策略,具有重要的临床意义。ACLY是一种主要分布于细胞核和细胞质中的线粒体外酶,由4个相同亚基通过C端聚合形成。ACLY可以将柠檬酸和辅酶A转化为乙酰辅酶A和草酰乙酸。乙酰辅酶A是脂质从头合成的主要原料,草酰乙酸是核苷酸和多胺类合成所必须的物质。有研究表明,ACLY在多种癌症中表达上调,其高表达与不良预后相关,抑制ACLY能抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭转移。肿瘤细胞的高增殖率和耐药率与物质代谢旺盛、细胞代谢重编程有关,调控肿瘤细胞代谢重编程已成为肿瘤治疗新的发展方向。文献报道,代谢重编程的主要特点包括脂质代谢的重塑和葡萄糖分解效率的增强。ATP柠檬酸裂解酶（ATP citrate lyase,ACLY）在连接细胞糖代谢和脂代谢过程中起到了关键作用,因此,靶向调控ACLY有望成为铂耐药卵巢癌治疗的新策略。本研究首先检测ACLY在EOC组织中的表达并分析其临床意义;采用体外细胞实验和裸鼠移植瘤实验检测敲减ACLY对EOC细胞增殖能力的影响及其分子机制;构建卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/CDDP并联合生信分析验证其生物学行为变化;采用细胞实验和裸鼠成瘤实验检测敲减ACLY对A2780/CDDP细胞顺铂耐药性的影响并探究其分子机制。第一部分 敲减ACLY对卵巢癌细胞增殖能力的影响及分子机制的研究研究目的:1.检测ACLY在卵巢癌组织中的表达和临床意义。2.探究敲减ACLY对卵巢癌细胞增殖能力的影响及其分子机制。材料与方法:研究材料:1.生物信息学资料:在GEO数据库中检索EOC组织和正常卵巢上皮（Ovarian surface epithelium,OSE）的转录组测序数据集,检索到的数据集为GSE18520、GSE14407、GSE36886,下载上述数据集的转录组数据。2.临床资料:收集2017年9月至2019年6月于山东大学齐鲁医院妇科就诊的47例EOC患者的临床信息和新鲜肿瘤组织;同时收集相同时间跨度的24例因子宫肌瘤等良性疾病行输卵管切除的患者的输卵管上皮（Fallopian tube epithelium,FTE）组织作为对照;两组患者的一般情况无统计学差异。本研究获得山东大学齐鲁医院伦理委员会的许可,标本提供者均知情且签署书面知情同意书（许可证号:DWLL-2019-011）。3.细胞系:人卵巢癌细胞系 A2780、OVCAR-3、HEY、OV-90、SKOV3、HO8910购买自中科院（上海）细胞库。研究方法:1.使用R语言对各数据集中ACLY的在EOC和OSE组织的表达差异进行分析。qRT-PCR法在收集的标本中检测EOC和FTE组织中ACLY的mRNA表达差异。应用KM Plotter网站分析TCGA和GEO数据库的数据,探究患者卵巢癌组织中ACLY表达与总生存期的关系。2.细胞实验:用shACLY和NC慢病毒转染A2780、SKOV3、HEY细胞构建稳定敲减ACLY的细胞和NC组细胞。MTT和平板克隆实验检测敲减ACLY对A2780、SKOV3、HEY体外增殖能力的影响。流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡比率,western blot检测敲减ACLY后A2780、SKOV3、HEY细胞内ACLY、PI3K/AKT通路相关分子以及其他蛋白分子的变化。3.动物实验:使用A2780-shACLY和A2780-NC细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,于接种10日后开始测量瘤径,隔天测量并记录,瘤块体积计算公式:体积=（长径×短径2）/2。于接种34天后处死裸鼠,剥离皮下移植瘤,测量瘤体重量与体积并拍照。研究结果:1.ACLY在EOC组织中的表达水平及其临床意义1.1 ACLY在EOC与OSE和FTE组织的表达:在GEO数据库中检索EOC和OSE组织的相关转录组测序数据集,在数据集GSE18520、GSE14407、GSE36886中分析ACLY的表达差异,发现EOC组织中ACLY表达高于OSE组织（P值分别为P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001,图1A-1C）。检测齐鲁医院47例EOC组织与24例FTE组织中ACLY mRNA水平,结果显示:EOC组织中ACLY mRNA的表达明显高于FTE组织（P=0.0206,图1D）。1.2 ACLY在EOC组织中的表达水平与患者总生存期的关系:用KM Plotter网站分析TCGA数据库和GEO数据集,对ACLY的表达量与患者总生存期长短进行分析并绘制生存分析曲线,结果显示:GSE15622、GSE18520、GSE30161数据集中ACLY高表达与预后差相关,差异具有统计学意义（P＜0.05）,TCGA数据集和GSE3554数据集统计学差异分别为P=0.051和P=0.05,表明ACLY高表达与总生存期短相关（图2A-2E）。2.ACLY蛋白在EOC细胞中的表达:western blot结果显示:在EOC细胞A2780、OVCAR-3、HEY、OV-90、SKOV3、HO8910 中,A2780、SKOV3、HEY细胞的ACLY表达较OVCAR-3、OV-90、HO8910细胞高,差异具有统计学意义（P＜0.01,图3）。3.敲减ACLY对EOC细胞增殖能力的影响及其分子机制的研究:含有shACLY和NC慢病毒载体转染A2780、SKOV3、HEY细胞,构建ACLY稳定敲减细胞株,qRT-PCR和western blot结果显示:敲减ACLY的A2780、SKOV3、HEY细胞中ACLY的mRNA和蛋白水平均明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.0001,图 4）。3.1敲减ACLY对EOC细胞增殖能力的影响:MTT实验结果显示:与NC组细胞相比,敲减ACLY的A2780、SKOV3和HEY细胞的增殖能力明显减弱,差异有统计学意义（P＜0.05,图5A）。平板克隆实验结果显示:在A2780、SKOV3和HEY细胞中,shACLY组细胞的克隆数明显少于NC组细胞,差异有统计学意义（P＜0.001,图5B）。3.2敲减ACLY对EOC细胞周期的影响及分子机制:流式细胞术检测敲减ACLY对EOC细胞周期分布的影响,结果显示:在A2780、SKOV3和HEY细胞中,shACLY组细胞G0/G1比例明显增多,差异有统计学意义（P＜0.001,图6A）。Western blot检测细胞中G0/G1周期蛋白检查点CDK4、CCND1以及CDK4的上游抑制分子P16的表达,结果显示:在A2780、SKOV3和HEY细胞中,shACLY组细胞中CDK4、CCND1的表达明显下调（P＜0.001,P＜0.01）,而P16的表达显著上调（P＜0.05,图6B）。结果表明,敲减ACLY通过P16-CDK4-CCND1轴引起G0/G1细胞周期阻滞。3.3敲减ACLY对EOC细胞凋亡的影响及分子机制:流式细胞术检测敲减ACLY对EOC细胞凋亡比率的影响,结果显示:敲减ACLY的A2780、SKOV3及HEY细胞的早期和晚期凋亡比率均明显升高（P＜0.001,图7）。Western blot检测细胞凋亡相关蛋白cleaved PARP的表达,结果显示:敲减ACLY的三种卵巢癌细胞中cleaved PARP表达均明显升高（P＜0.05）,而pan-AKT和p-AKT的表达明显下调（P＜0.05,P＜0.05）,AKT表达和功能的下调促进细胞凋亡。SKOV3细胞是P53缺失的细胞,敲减ACLY对其P53的表达无法产生影响;在A2780和HEY中,敲减ACLY可引起P53表达明显上调（P＜0.05,图6B）。以上结果表明,A2780、SKOV3、HEY三种细胞中敲减ACLY均可抑制AKT通路引起细胞凋亡,A2780和HEY中敲减ACLY激活P53引起细胞凋亡。4.敲减ACLY对裸鼠EOC细胞皮下移植瘤生长的影响:用A2780-shACLY和A2780-NC细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型。结果显示:于接种后第16天开始A2780-shACLY移植瘤的体积明显小于对照组,差异有统计学意义（P＜0.01）（图8A、B）。对裸鼠移植瘤测量和称重,A2780-NC组肿瘤重量为1.6944±0.28g,A2780-shACLY组的肿瘤重量为1.12±0.13g,两组肿瘤重量对比差异有统计学意义（P=0.0034,图8C）。结论:1.ACLY在EOC组织中高表达,且ACLY高表达与不良预后相关。2.敲减ACLY在体内外均可抑制EOC细胞的增殖,诱导EOC细胞发生周期阻滞并促进细胞凋亡。第二部分 顺铂获得性耐药细胞株A2780/CDDP的构建及其生物学行为的研究研究目的:1.生物信息学分析GEO数据库中获得性顺铂耐药卵巢癌细胞株A2780/CDDP与敏感细胞株A2780基因表达的差异。2.构建A2780/CDDP细胞株,研究其生物学行为变化。材料与方法:研究材料:生物信息学资料:GEO数据库中GSE15709数据集,系A2780/CDDP细胞与其亲本株A2780细胞的转录组测序数据,数据下载自网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE15709）。研究方法:1.使用R/R Studio软件对GSE15709数据集进行处理,使用limma R包分析两种细胞株的差异表达基因,差异基因的筛选标准为log2|FC| ≥1并且P＜0.05,用clusterProfiler R包对差异表达基因进行GO和KEGG通路富集。2.构建A2780/CDDP细胞:应用高剂量顺铂、短时间、反复作用A2780细胞的方法构建A2780/CDDP细胞;MTT法检测顺铂对A2780和A2780/CDDP细胞的IC50;以生信分析筛选出的表达差异蛋白为研究对象,western blot法验证其在A2780和构建成功的A2780/CDDP细胞中的表达差异。研究结果:1.GSE15709中A2780/CDDP与A2780细胞差异表达基因分析及通路富集:将A2780/CDDP与A2780细胞的转录组测序结果通过Limma R包分析差异表达的基因,筛选条件为log2|FC|≥1并且P＜0.05,共筛选出1468个基因,其中上调的基因有640个,下调的基因有828个（图1A）。ACLY在耐药细胞株中明显上调（log2FC=1.42,P=0.00059,图1B）。对筛选出的差异基因进行GO和KEGG数据库通路富集分析,结果发现:差异基因在PI3K/AKT通路中明显富集,差异具有显著性（P＜0.05,图1C）。2.构建A2780/CDDP细胞株,探究其生物学行为变化2.1构建A2780/CDDP细胞并验证其对顺铂的耐药性:以终浓度为50μM的顺铂冲击、短时间、反复作用A2780细胞方法构建卵巢癌顺铂耐药细胞系A2780/CDDP。MTT法检测A2780/CDDP和A2780细胞对顺铂的耐药性,结果显示:顺铂作用24、48、72小时,A2780/CDDP细胞的IC50分别约是A2780细胞的3、5、10倍（图2A）。平板克隆形成实验结果显示:A2780/CDDP组细胞存活率明显高于A2780组细胞（P＜0.001,图2B）,表明A2780/CDDP细胞对顺铂明显耐药。2.2检测A2780/CDDP细胞的生物学行为变化:MTT实验结果显示:顺铂耐药的A2780/CDDP细胞增殖能力明显弱于A2780细胞,且差异具有统计学意义（P＜0.001,图3A）。平板克隆实验结果显示:无顺铂作用下,A2780/CDDP细胞的克隆形成能力弱于A2780细胞,差异有统计学意义（P＜0.001）（图3B）。2.3检测ACLY、PI3K/AKT通路相关蛋白在A2780/CDDP细胞中的表达:western blot 结果显示:与 A2780 细胞相比,ACLY、P13K、pan-AKT、p-AKT在A2780/CDDP细胞中表达上调且差异具有显著性（P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01）,p-AMPK-α表达下调且差异有统计学意义（P＜0.0001）,与生信分析结果一致（图4A、B）。结论:1.成功构建获得性顺铂耐药细胞株A2780/CDDP。2.A2780/CDDP细胞耐药性的产生与ACLY表达上调激活PI3K/AKT通路、抑制AMPK活化有关。第三部分 抑制ACLY调控A2780/CDDP顺铂耐药的分子机制研究研究目的:1.探究敲减ACLY对A2780/CDDP细胞增殖能力的影响。2.探究敲减ACLY对A2780/CDDP细胞顺铂耐药性的影响及分子机制。3.探究ACLY特异性抑制剂对A2780/CDDP细胞顺铂耐药性的影响。材料方法:1.细胞实验:MTT法和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;MTT法检测顺铂对细胞作用的IC50;流式细胞术检测细胞凋亡比率;反应性氧化物ROS检测试剂盒和酶标仪检测法检测细胞中ROS含量;western blot法检测细胞内蛋白的表达。2.质粒转染:AKT过表达质粒转染A2780/CDDP-shACLY及A2780/CDDP-NC细胞。3.动物实验:分别构建A2780/CDDP-shACLY和A2780/CDDP-NC细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,于成瘤的第7/14/21天分别给予顺铂腹腔注射,剂量根据小鼠体重决定,按照4mg/kg给药。于接种10日后开始测量瘤径,隔天测量并记录,瘤块体积计算公式:体积=（长径×短径2）/2,于接种34天后处死裸鼠,剥离皮下移植瘤,测量瘤体重量与体积并拍照。研究结果:1.敲减ACLY对A2780/CDDP细胞增殖能力的影响:MTT法检测敲减ACLY对A2780/CDDP细胞增殖的影响,结果显示,A2780/CDDP-shACLY细胞的增殖速度明显低于A2780/CDDP-NC细胞,差异有统计学意义（P＜0.001,图1A）。平板克隆实验结果显示,A2780/CDDP-shACLY细胞克隆形成的数量少于A2780/CDDP-NC细胞,差异有统计学意义（P＜0.001）（图1B）。2.敲减ACLY对A2780/CDDP细胞顺铂耐药性的影响及分子机制的研究2.1敲减ACLY对A2780/CDDP细胞顺铂耐药性的影响:MTT实验检测并计算顺铂对A2780/CDDP-shACLY细胞和A2780/CDDP-NC细胞的IC50,结果显示:在顺铂作用24、48、72小时,A2780/CDDP-shACLY细胞的IC50均小于A2780/CDDP-NC细胞（图2A）。平板克隆实验结果显示10μM和20μM顺铂分别作用细胞后,与A2780/CDDP-NC细胞相比,A2780/CDDP-shACLY细胞克隆的存活比率明显降低,差异有统计学意义（P＜0.001,图2B）。2.2敲减ACLY对A2780/CDDP细胞顺铂耐药性影响的分子机制研究2.2.1敲减ACLY的A2780/CDDP细胞经顺铂作用后胞内相关蛋白的表达变化:western blot 检测结果显示:与 A2780/CDDP-NC 细胞相比,A2780/CDDP-shACLY细胞内PI3K/AKT通路中的关键蛋白PI3K、pan-AKT和p-AKT均明显下调,p-AMPK-α表达上调（P＜0.05）。顺铂可同时下调两组细胞内PI3K、pan-AKT、p-AKT 的表达、上调 p-AMPK-α 的表达,与 A2780/CDDP-NC 细胞相比,顺铂作用后A2780/CDDP-ACLY组细胞中蛋白表达的变化更显著,差异具有统计学意义（P＜0.05,图3A）。2.2.2敲减ACLY的A2780/CDDP细胞经顺铂作用后胞内ROS生成的变化:ROS生成实验结果显示:与A2780/CDDP-NC细胞相比,A2780/CDDP-shACLY细胞内ROS的产生增多（P＜0.0001）;顺铂作用下两组细胞的ROS生成均增加,A2780/CDDP-shACLY细胞中 ROS增加程度明显高于A2780/CDDP-NC细胞,差异有统计学意义（P＜0.05,图3B）。2.3敲减ACLY对顺铂诱导A2780/CDDP细胞凋亡的影响:流式细胞术检测10μM、20μM 顺铂作用 A2780/CDDP-shACLY 和 A2780/CDDP-NC 细胞 24、48、72小时后的细胞凋亡率,结果显示:与A2780/CDDP-NC细胞相比,顺铂诱导的A2780/CDDP-shACLY细胞凋亡率随着顺铂浓度的增加而增加,差异有统计学意义（P＜0.001,图4A）。Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白的表达,结果显示:A2780/CDDP-shACLY细胞内 cleaved PARP 的表达较A2780/CDDP-NC细胞明显上调,差异有统计学意义（P＜0.05）;20μM顺铂同时上调两组细胞内cleaved PARP蛋白的表达,与A2780/CDDP-NC细胞相比,A2780/CDDP-shACLY细胞内cleaved PARP表达增多,差异有统计学意义（P＜0.01,图 4B）。2.4动物实验探究敲减ACLY对A2780/CDDP细胞顺铂耐药性的影响:分别使用A2780/CDDP-NC和A2780/CDDP-shACLY细胞构建裸鼠皮下成瘤模型,给予裸鼠顺铂腹腔注射,结果显示:顺铂作用后,A2780/CDDP-shACLY移植瘤的体积和重量明显小于对照组。A2780/CDDP-NC移植瘤的重量为1.9288±0.6307g,A2780/CDDP-shACLY移植瘤的重量为 0.6072±0.3087g,差异有统计学意义（P＜0.01,图5A、B）。3.ACLY特异性抑制剂SB-204990联合顺铂对A2780/CDDP细胞的生长抑制作用:MTT实验检测低浓度ACLY特异性小分子抑制剂SB-204990（0μM、10μM、20μM、30μM）单独或联合顺铂（4μM、8μM、16μM、32μM、64μM）作用A2780/CDDP细胞后细胞生长抑制率,结果显示:SB-204990单药使用不影响细胞增殖（图6A）;不同浓度的SB-204990（0μM、10μM、20μM、30μM）分别与顺铂联合24、48、72小时后,随着SB-204990浓度的升高,顺铂对A2780/CDDP细胞的IC50逐步下降（图6B）。4.上调A2780/CDDP-shACLY细胞中AKT的表达对细胞的影响4.1上调A2780/CDDP-shACLY细胞中AKT的表达对细胞顺铂耐药性的影响:将过表达AKT质粒和NC质粒分别瞬时转染A2780/CDDP-NC和A2780/CDDP-shACLY细胞,MTT法检测顺铂对四种细胞作用的IC50,结果显示:在 A2780/CDDP-NC-NC、A2780/CDDP-NC-AKT、A2780/CDDP-shACLY-NC、A2780/CDDP-shACLY-AKT细胞中,顺铂作用24、48、72小时后,细胞的IC50均随着时间延长呈下降趋势,但在相同作用时间下,A2780/CDDP-NC-AKT细胞的IC50与A2780/CDDP-NC-NC细胞的IC50无明显差异,A2780/CDDP-shACLY-NC 细胞的 IC50较 A2780/CDDP-NC-NC 细胞的 IC50 降低,A2780/CDDP-shACLY-AKT 细胞的 IC50 较 A2780/CDDP-shACLY-NC 细胞的IC50升高（图7B）。表明过表达AKT能部分逆转因为ACLY敲减导致的细胞耐药性的下降,敲减ACLY通过抑制PI3K/AKT通路增强A2780/CDDP细胞的对顺铂的敏感性。4.2上调A2780/CDDP-shACLY细胞中AKT的表达对顺铂诱导凋亡的影响及分子机制:流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示:20μM顺铂作用24、48和72小时后,随着时间延长,四种细胞中凋亡细胞比率均有升高;在顺铂相同作用时间下,A2780/CDDP-shACLY-AKT 细胞凋亡率较 A2780/CDDP-shACLY-NC细胞明显降低（P＜0.05,图8A）。Western blot检测20μM顺铂作用48小时后细胞内相关蛋白的表达,结果显示:在20μM顺铂作用48小时后,四种细胞中,过表达AKT的细胞中pan-AKT、p-AKT表达上调,差异均有统计学意义（P＜0.001）,A2780/CDDP-shACLY-AKT 细胞中 cleaved PARP 表达较A2780/CDDP-shACLY-NC细胞下调,差异有统计学意义（P＜0.001）。过表达AKT后,PI3K蛋白的表达无明显变化（P＞0.05,图8B）。结论:1.敲减ACLY通过抑制PI3K/AKT、激活AMPK/ROS通路增强A2780/CDDP细胞对顺铂的敏感性。2.低浓度ACLY小分子抑制剂SB-204990明显增强A2780/CDDP细胞对顺铂的敏感性。