心血管疾病目前已成为威胁人类健康与生命的头号杀手，其发病率和死亡率超过肿瘤性疾病跃居第一。我国每年约有300余万人死于心血管疾病，占全部死亡原因的40%。而心血管疾病机制复杂，目前仍不明确，因此，针对心血管疾病的防治作用研究显得尤为重要。众所周知，内质网的主要功能是蛋白质的合成、折叠和转运。约有三分之一的细胞蛋白在内质网中合成，因此维持内质网内环境的稳定是保证内质网功能的必备条件。但有很多因素可导致内稳态的失衡，形成内质网应激，例如：缺血再灌注损伤、氧化应激、物理和化学因素等。过去10年的研究发现，内质网应激参与了多种心血管疾病的发病机制。近年来随着工作和生活压力的增大，高血压的发病率逐年升高。2013年我国高血压防治指南数据显示，每5名成年人中就有1名高血压患者。而越来越多的文献也报道，内质网应激参与了高血压的病理生理过程，但其机制复杂至今尚未完全明确。研究证实，一种富含半胱氨酸，具有结合金属能力的重金属清除剂，金属硫蛋白（Metallothionein，MT）具有良好的心脏保护功能，特别是在衰老、肥胖、胰岛素抵抗以及糖尿病性心脏病中，通过清除过多的活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS），恢复氧化-还原平衡，实现有效的心脏保护。近来有文献报道，降低氧化应激，可以有效地保护线粒体功能，从而降低内质网应激。因此我们提出假说，金属硫蛋白是否可以有效减轻内质网应激所致的心肌损伤，阐明这一问题将会为心肌损伤的机制研究提供新的视角和理论依据。本课题拟在前期工作及已有文献报道基础上，首先通过研究金属硫蛋白对内质网应激所致心肌损伤是否具有保护作用，探讨自噬和凋亡在这一过程中的可能作用；进而观察MT对高血压心肌损伤的保护作用，最后从线粒体水平探讨心肌损伤的机制。第一部分金属硫蛋白减轻内质网应激后心肌损伤的机制研究实验一自噬的作用目的：研究金属硫蛋白（MT）是否可以改善衣霉素（Tunicamycin，TN）诱导的内质网应激所致的心肌损伤，同时研究自噬与氧化应激的关系以及在本实验中所起的作用。方法：野生型小鼠（Wild-type friendly virus B，FVB）和金属硫蛋白心肌特异性过表达小鼠（Metallothionein，MT）（雄性，5-6月），随机分为四组：FVB、FVB+TN、MT和MT+TN。TN组腹腔注射TN（1mg/kg/d）共2d，48h后，分别进行各组超声心动图、单个心肌细胞收缩、舒张和细胞内钙瞬变检测；DCF染色检测心肌组织ROS量；Western Blot检测内质网应激的相关蛋白GRP78、GADD153、eIF2α、p-eIF2α、 IRE1α、p-IRE1α以及自噬相关蛋白ULK1、p-ULK1（Ser777）、Atg5、Atg7、LC3B的水平；分离小鼠心肌细胞并给予自噬抑制剂3-MA或抗氧化剂NAC，孵育2h后，检测给药后单个心肌细胞收缩和舒张功能。结果：腹腔注射TN2d后，超声心动图结果显示，FVB+TN组的左心室收缩末期内径（LVESD）和左心室舒张末期内径（LVEDD）较FVB空白组明显增大，左室短轴缩短分数（FS）较FVB空白组显著降低（p<0.05），过表达的MT可以明显减轻TN所致的左心室收缩和舒张功能的降低（p<0.05）；单个心肌细胞收缩和舒张功能以及细胞内钙瞬变检测显示，TN明显降低了FVB小鼠单个心肌细胞收缩峰值（PS）、最大收缩速率（+dL/dt）、最大舒张速率（-dL/dt）和钙荧光值变化量（ΔFFI），并延长了心肌细胞舒张90%时间（TR90）和钙荧光值消退时间（Ca2+decay rate）（p<0.05），过表达MT可明显改善上述指标的改变，明显减轻TN对心肌细胞收缩和舒张功能以及细胞内钙瞬变的损伤作用（p<0.05）；DCF染色显示，FVB+TN组较FVB组ROS量明显增加，过表达的MT可以显著减少TN所致ROS量的增加（p<0.05）；Western Blot结果显示，FVB+TN组较FVB组内质网应激的相关蛋白GRP78、GADD153、p-eIF2α、p-IRE1ɑ以及自噬相关蛋白p-ULK1（Ser777）、Atg5、Atg7、LC3B和p62水平明显升高（p<0.05），而过表达MT可以明显逆转TN所致上述蛋白表达量的变化（p<0.05）。细胞给药后，心肌细胞收缩功能显示，FVB+TN+3MA，FVB+TN+NAC与FVB+TN组相比，两组心肌细胞收缩峰值、最大收缩和舒张速率均明显增加以及心肌细胞舒张90%时间明显缩短（p<0.05），两组上述指标与FVB组相比无显著性差异（p＞0.05），证明自噬抑制剂3MA和抗氧化剂NAC可以恢复TN所致FVB小鼠心肌细胞的收缩和舒张功能损伤，即有效地抑制自噬和抗氧化，在TN所致的心肌损伤中具有保护作用。实验二凋亡的作用目的：研究金属硫蛋白（MT）能否改善内质网应激（TN诱导）所致的心肌损伤以及对线粒体功能和凋亡信号通路的作用。方法：野生型小鼠（Wild-type friendly virus B，FVB）和金属硫蛋白心肌特异性过表达小鼠（Metallothionein，MT）（雄性，5-6月），被随机分为四组：FVB、FVB+TN、MT和MT+TN。TN组腹腔注射TN（1mg/kg/d）共2d，48h后，分别进行各组小鼠的超声心动图、单个心肌细胞收缩、舒张功能和细胞内钙瞬变检测；同时用JC-1荧光检测线粒体膜电位情况；检测Caspase-3活性观察心肌细胞凋亡情况；WesternBlot检测内质网应激的相关蛋白GRP78、GADD153、eIF2α、p-eIF2α、 IRE1ɑ、p-IRE1ɑ以及凋亡信号通路相关蛋白BAX、Bcl-2、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的水平变化。结果：腹腔注射TN2d后，超声心动图检测发现FVB+TN组与FVB空白组相比，左心室收缩末期内径（LVESD）和左心室舒张末期内径（LVEDD）显著增大，左室短轴缩短分数（FS）明显降低（p<0.05），过表达的MT可以明显减轻TN对左心室收缩和舒张功能的损伤（p<0.05）；单个心肌细胞收缩和舒张功能以及细胞内钙瞬变检测显示，TN明显降低了FVB小鼠单个心肌细胞收缩峰值（PS）、最大舒张速率（-dL/dt）、最大收缩速率（+dL/dt）和钙荧光值变化量（ΔFFI），延长了单个心肌细胞舒张90%的时间（TR90）和钙荧光值消退时间（Ca2+decay rate）（p<0.05），过表达MT可以明显减轻TN对心肌细胞收缩、舒张功能和细胞内钙瞬变的损伤（p<0.05）；JC-1荧光检测显示，FVB+TN组较FVB组线粒体膜电位水平明显降低，过表达MT明显地缓解TN所致的线粒体膜电位水平的降低（p<0.05）；Western Blot结果显示，FVB+TN组较FVB组内质网应激的相关蛋白GRP78、GADD153、p-eIF2α、p-IRE1ɑ以及凋亡相关蛋白BAX、Caspase-9和内质网应激所致凋亡的关键蛋白Caspase-12的水平明显升高（p<0.05），过表达MT可以明显地缓解TN所致的上述蛋白表达量的变化（p<0.05）；Caspase-3活性检测结果趋势与Western Blot结果相同，表明TN所致的内质网应激可以引起FVB组凋亡明显增加，过表达MT显著地减少心肌细胞凋亡的产生。第二部分金属硫蛋白对高血压所致心肌损伤的心肌保护作用的机制研究实验一自噬的作用目的：研究重金属硫蛋白（MT）是否可以改善高血压（L-NAME诱导）所致的心肌损伤，同时研究自噬和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在其中的作用。方法：野生型小鼠（Wild-type friendly virus B，FVB）和金属硫蛋白心肌特异性过表达小鼠（Metallothionein，MT）（雄性，5-6月），被随机分为四组：FVB、FVB+L-NAME、MT和MT+L-NAME。L-NAME组在饮用水中加入L-NAME（NO合酶抑制剂，0.1g/L），对照组饮用自来水。处理14天后，分别检测各组血压、超声心动图、单个心肌细胞收缩和舒张功能以及细胞内钙瞬变的检测；进行WGA和Masson染色检测心肌细胞大小及心肌组织间隙纤维化程度；Western Blot检测mTOR信号通路相关分子AMPKɑ、p-AMPKɑ（Thr172）、TSC2、p-TSC2（Thr1462）、mTOR、p-mTOR（Ser2448）、p70S6K、p-p70S6K（Ser424）以及自噬相关蛋白ULK1、p-ULK1（Ser777）、LC3B和P62的水平；随后，在在体和细胞模型分别给予自噬抑制剂3-MA或自噬的激动剂雷帕霉素（Rapamycin, RAPA），检测给药后心肌细胞收缩和舒张功能。结果：L-NAME处理14d后，FVB+L-NAME组和MT+L-NAME组，两组血压均较对照组明显升高（p<0.05）；超声心动图检测发现FVB+L-NAME组的左心室收缩末期内径（LVESD）和左心室舒张末期内径（LVEDD）较FVB空白组明显增大，左室短轴缩短分数（FS）较FVB空白组显著降低（p<0.05），过表达MT可以明显减轻L-NAME对左心室收缩和舒张功能的损伤（p<0.05）。单个心肌细胞收缩、舒张功能和细胞内钙瞬变检测显示，L-NAME明显的降低了FVB小鼠单个心肌细胞收缩峰值（PS）、最大收缩速率（+dL/dt）、最大舒张速率（-dL/dt）和钙荧光值变化量（ΔFFI），延长了舒张90%时间（TR90）和钙荧光值消退时间（Ca2+decay rate）（p<0.05），过表达MT明显减轻L-NAME对心肌细胞收缩、舒张功能和细胞内钙瞬变检测的损伤（p<0.05）。Masson染色显示，FVB+L-NAME组较FVB组心肌组织间隙发生明显纤维化（p<0.05）；WGA染色显示，L-NAME使FVB组小鼠细胞明显增大（p<0.05），过表达MT可以明显减轻L-NAME所致的心肌组织间隙的纤维化以及心肌细胞的增大（p<0.05）；Western Blot结果显示，FVB+L-NAME组较FVB组p-AMPKɑ（Thr172）、p-TSC2（Thr1462）水平明显下降，p-mTOR（Ser2448）、p-p70S6K（Ser424）水平明显升高，同时自噬相关蛋白p-ULK1（Ser777）、LC3B显著降低，P62明显升高（p<0.05），过表达MT可以显著缓解L-NAME所致的上述蛋白表达量的变化（p<0.05）；体内给药，心肌细胞的收缩和舒张功能显示，FVB+L-NAME+3MA、MT+L-NAME+3MA两组均明显地降低了心肌细胞收缩峰值、最大收缩和舒张速率以及延长了舒张90%时间（p<0.05），3MA消除了MT的心肌细胞保护作用；细胞给药，心肌细胞收缩和舒张功能显示，FVB+L-NAME+RAPA，MT+L-NAME+RAPA两组所有指标与空白组相比无显著差异（p＞0.05），表明RAPA恢复了FVB小鼠心肌细胞的收缩和舒张功能，即恢复自噬水平可以有效减轻L-NAME所致高血压的心肌细胞损伤。实验二凋亡的作用目的：研究在重金属清除剂金属硫蛋白（MT）改善高血压（L-NAME诱导）所致的心肌损伤中，线粒体功能及膜电位情况和凋亡信号通路在其中的作用。方法：野生型小鼠（Wild-type friendly virus B，FVB）和金属硫蛋白心肌特异性过表达小鼠（Metallothionein，MT），随机分为四组：FVB、FVB+L-NAME、MT和MT+L-NAME。L-NAME组在饮用水加入L-NAME（NO合酶抑制剂，0.1g/L），对照组饮用自来水。处理14天后，分别检测各组血压、超声心动图、单个心肌细胞收缩、舒张功能和细胞内钙瞬变检测。同时用JC-1和TUNEL染色检测线粒体膜电位以及心肌细胞凋亡情况；Western Blot检测凋亡信号通路相关蛋白BAX、BAD、p-BAD、Bcl-2以及Caspase-9和Caspase-12的变化水平。结果：L-NAME处理14d后，FVB+L-NAME组和MT+L-NAME组，两组血压均较对照组明显升高（p<0.05）；超声心动图检测发现FVB+L-NAME组的左心室收缩末期内径（LVESD）和左心室舒张末期内径（LVEDD）较FVB空白组明显增大（p<0.05），心脏短轴缩短分数（FS）较FVB空白组显著降低（p<0.05），过表达MT可以明显减轻L-NAME所致的左心室收缩和舒张功能损伤（p<0.05）；单个心肌细胞收缩、舒张功能和细胞内钙瞬变检测显示，L-NAME明显降低了FVB组小鼠单个心肌细胞收缩峰值（PS）、最大舒张速率（-dL/dt）、最大收缩速率（+dL/dt）和钙荧光值变化量（ΔFFI），延长了舒张90%时间（TR90）和钙荧光值消退时间（Ca2+decay rate）（p<0.05），过表达MT显著减轻L-NAME所致高血压对心肌细胞收缩、舒张功能和细胞内钙瞬变的损伤（p<0.05）；JC-1荧光染色显示，FVB+L-NAME组较FVB组线粒体膜电位水平明显下降（p<0.05）；TUNEL染色显示，L-NAME使FVB组凋亡的心肌细胞数量明显增多（p<0.05），过表达MT可以明显提高L-NAME所致的线粒体膜电位水平的下降以及减少心肌细胞凋亡的数量（p<0.05）；WesternBlot结果显示，FVB+L-NAME组较FVB组p-BAD和Bcl-2水平明显下降，Caspase-9和内质网应激的标志蛋白Caspase-12的水平明显升高（p<0.05），BAD蛋白表达量无明显变化，过表达的MT可以明显地缓解L-NAME所致的上述蛋白表达量的变化（p<0.05）；Caspase-3活性检测结果趋势与TUNEL染色和Western Blot结果相同。该组实验数据表明，在L-NAME所致的高血压心肌损伤模型中，FVB组心肌细胞凋亡明显增加，而过表达MT显著地减少心肌细胞的凋亡。小结通过以上研究，我们发现金属硫蛋白（MT）能有效减轻内质网应激所致的心肌损伤。MT通过其抗氧化功能，降低内质网应激，降低心肌的自噬水平，改善线粒体功能和维持膜电位水平，减少心肌细胞凋亡，从而发挥心肌的保护作用；此外，在L-NAME所致的高血压模型中，MT通过抑制mTOR，恢复自噬水平，提高线粒体的膜电位水平，降低内质网应激，减少心肌细胞凋亡，从而改善L-NAME所致的高血压引起的心肌损伤。