研究背景代谢性疾病系代谢系统紊乱引起的疾病,不仅包括常见的糖尿病、低血糖、肥胖、高尿酸血症、骨代谢异常,还包括罕见的遗传性代谢疾病。近年来的研究显示,生物节律与多种疾病的发生发展密切相关。生物钟紊乱如:轮班工作、社交时差、夜间进食可增加糖尿病、肥胖、癌症、心血管疾病及精神疾病的发病率;节律医学,包括时间药理学、时间营养学、时间运动学等能够优化药物治疗效果并治疗糖尿病、肥胖等代谢性疾病。因此,节律医学的出现为代谢性疾病的防治提供了新的靶点。哺乳动物的生物钟控制基团位于中枢神经下丘脑的视交叉上核（Suprachiasmaticnucleus,SCN）,自然界光-暗信号激活视网膜神经节细胞后,通过视丘脑束刺激SCN,SCN自主地控制神经元放电及基因表达产生昼夜节律,并将节律信号传递到全身。CLOCK（Circadian locomotor output cycles kaput）、Bmal1（Bain and muscle ARNT-like 1）、Pers（Period）、Crys（Cryptochrome）、Rev-erbs（nuclear receptor subfamily 1,group D）及 RORs（RAR-related orphan receptor）共同组成了生物钟调控的核心分子基础。近年来,研究发现骨骼肌、心脏、肝脏及脂肪等外周组织器官存在独立的生物钟系统并参与了对代谢的调书,该领域逐渐成为当前研究的热点。多项人体及动物方面的研究发现骨骼肌生物钟系统紊乱可造成代谢异常。骨骼肌是人体最大的器官,其重量占人体体重的45%,餐后85%的葡萄糖均由骨骼肌吸收,骨骼肌也是人体氨基酸最主要的储备库,骨骼肌代谢异常是2型糖尿病重要的发病因素,但是具体机制尚不明确。骨骼肌脂质的异常堆积可降低胰岛素的敏感性、导致糖代谢异常,从而表现为脂毒性。然而,“运动员悖论”提示脂毒性并不能解释骨骼肌糖代谢异常:与正常人群相比,运动员肌肉脂肪含量是增加的,其胰岛素敏感性同样是增高的。葡萄糖-脂肪酸循环（Randle循环）学说提出,葡萄糖与脂肪酸作为组织器官供能的主要燃料,存在竞争性地相互抑制。我们团队前期的研究发现骨骼肌HDAC3（Histone deacetylase 3）特异性敲除小鼠表现为骨骼肌脂肪酸利用增加,葡萄糖利用减少,从而造成糖耐量减退及胰岛素抵抗,以上研究提示骨骼肌糖脂代谢的能力而非脂质堆积是导致糖代谢异常的主要原因。HDAC3与生物钟系统关系密切,生物钟的关键基因Rev-erbα可通过招募HDAC3、NCoR（nuclear receptor corepressor）调控下游靶基因的表达。Rev-erbα 与Rev-erbβ 是核受体超家族（Nuclear receptor superfamily,NRs）成员之一,是生物钟核心调控系统的重要组成部分,在中枢系统、骨骼肌、脂肪、肝脏等组织器官有较高的表达。通过氨基酸序列分析发现,Rev-erbβ与Rev-erbα有着相似的蛋白结构和功能,两者DNA结合域（DNA binding domain）相似度高达96%,Rev-erbβ 能够直接与 Rev-erbα 结合位点结合。Rev-erbα、Rev-erbβ 相互协调,共同参与生物钟调控、糖脂代谢等多个生物学过程。但是,Rev-erbs在骨骼肌中的功能仍存在争议:2013年Woldt等人构建了 Rev-erbα全身敲除（Rev-erbα-/-）小鼠,发现Rev-erbα-/-小鼠骨骼肌线粒体自噬功能异常,小鼠运动耐力及运动时的耗氧量明显下降,然而Rev-erbα-/-小鼠的自主运动是明显减少的。因此,该鼠模型运动耐力及运动时耗氧量的改变可能是继发于显著减少的自主运动。为了进一步明确Rev-erbs在骨骼肌中的具体功能,本研究构建了骨骼肌特异性Rev-erbα、Rev-erbβ敲除小鼠模型,通过各种生理学实验明确Rev-erbs对骨骼肌的调控作用。近年来,多组学技术（基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白组学）的应用为代谢性疾病的研究提供了更广阔的视野,提高了罕见遗传性代谢疾病的诊断率,使研究者能够更加准确地阐述代谢性疾病的发生发展规律,极大地为推动了精准医学的发展。因此,本研究通过整合转录组、代谢组、染色质免疫共沉淀测序（Chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq）多组学技术,对骨骼肌 Rev-erbs 的作用机制进行深入地探讨。在临床研究方面,我们报道了一例严重低血糖合并异常脂肪堆积的罕见病患儿。患儿自出生后7个月开始出现腰腹部脂肪堆积并逐渐加重,4岁时出现骨骼肌萎缩及反复低血糖,血糖最低为0.79mmol/L,低血糖发作时伴有严重的抽搐、意识丧失。影像学及其他相关辅助检查提示糖脂代谢异常性疾病,但病因不明。根据Randle循环学说,葡萄糖-脂肪酸利用障碍可部分解释该病例的病理生理学改变。为了检测有无糖脂代谢相关酶或其辅因子的基因突变,我们对先证者一家三口的血样进行了全基因组测序分析以明确该病例的分子诊断,并对可疑的基因、突变位点分别进行了蛋白水平、一代测序方面的验证。第一部分骨骼肌Rev-erbs对小鼠代谢、力量及耐力的影响目的探究骨骼肌Rev-erbs对小鼠体重、进食、肌肉力量、运动耐力、糖脂代谢能力及线粒体功能的影响。方法1.通过将基因型为Rev-erbα（loxp/loXP）/Rev-erbβ（loxp/loxp）（MGI ID 5426700,MGI ID 5426699）的 C57BL/6小鼠与基因型为 MLC-Cre（myosin light chain lf promoter,MGI ID 1931135）的C57BL/6小鼠杂交,得到骨骼肌Rev-erbα/β特异性敲除小鼠 Rev-MKO（skeletal muscle-specific Rev-erbα/β double knockout mice）,以无MLC-Cre的Rev-erbα（loxp/loXP）/Rev-erbβ（loxp/loxp）小鼠作为野生型WT（wild type）对照。本研究所有实验数据均取自雄鼠。通过RT-qPCR鉴定不同组织器官Rev-erbα、Rev-erbβ的敲除效率。2.每周监测小鼠体重,应用实验动物综合监控系统（Comprehensive Lab Animal Monitor System,CLAMS）监测小鼠昼夜进食量、自主运动量、能量消耗及耗氧量。3.分别应用RT-qPCR及western blot检测小鼠肌肉线粒体DNA拷贝数及氧化磷酸化复合物（OXPHOS）蛋白水平的变化。4.提取小鼠胫骨前肌（Tibialis anterior muscle,TA）、比目鱼肌（Soleus,Sol）及趾长伸肌（Extensor Digitorum Longus,EDL）并计量肌肉重量,通过免疫荧光染色检测小鼠胫骨前肌肌纤维数量、肌纤维类型。5.通过握力实验及吊线实验检测小鼠的肌力,通过跑步机检测不同运动强度下小鼠的运动耐力。6.将小鼠放入跑步机运动15分钟后,腹腔注射[3H]-棕榈酸,放回跑步机继续运动15分钟后,通过尾静脉取血检测[3H]水含量,以反映小鼠运动时脂肪酸β氧化能力。将小鼠置于跑步机运动后30分钟后,通过尾静脉取血检测血清乳酸水平,间接反映小鼠运动时的糖酵解能力。小鼠禁食6小时后,通过检测肌肉糖原、甘油三酯含量反映肌肉脂肪酸及葡萄糖利用的能力。将小鼠放入能够检测耗氧量及二氧化碳产量的跑步机上,通过呼吸交换率评价小鼠运动时葡萄糖、脂肪酸的利用率。7.提取原代肌肉细胞在体外诱导分化为肌细胞,通过[3H]-2-脱氧葡萄糖及[3H]-棕榈酸干预后,分别检测肌细胞葡萄糖摄取及脂肪酸β氧化的能力。8.小鼠禁食6小时后,检测血清葡萄糖及胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR;通过腹腔注射葡萄糖耐量实验（IPGTT）检测小鼠葡萄糖耐量。结果1.RT-qPCR结果显示,Rev-erbα及Rev-erbβ在Rev-MKO小鼠胫骨前肌、股四头肌、腓肠肌及比目鱼肌中的表达明显下降,而在心脏、肝脏及下丘脑中无明显变化。与Rev-erbα-/-小鼠模型不同,Rev-MKO小鼠昼夜进食量、自主运动、能量消耗及耗氧量无明显变化。2.Rev-MKO小鼠骨骼肌线粒体DNA拷贝数及OXPHOS蛋白水平无明显变化。3.Rev-MKO小鼠肌肉重量、肌纤维数量及类型无明显变化。4.握力实验显示Rev-MKO小鼠握力下降,吊绳实验显示Rev-MKO吊绳时间缩短。Rev-MEKO小鼠在高强度运动时的运动耐力减弱,而在慢跑运动时（中低强度）的运动耐力增加。5.Rev-MKO小鼠运动时脂肪酸β氧化的能力增加,产生的乳酸减少,呼吸交换率下降,提示脂肪酸利用增加,而葡萄糖利用减少。禁食后,Rev-MKO小鼠骨骼肌糖原含量增加、而甘油三酯含量减少。6.Rev-MKO小鼠的原代肌肉细胞体外诱导分化为肌细胞后,[3H]-2-脱氧葡萄糖的摄取能力减弱,而[3H]-棕榈酸的氧化能力增强。结果提示,Rev-MKO小鼠糖脂代谢能力的改变是由骨骼肌Rev-erbs直接介导的。7.小鼠禁食6小时后,Rev-MKO小鼠HOMA-IR有增加的趋势（p=0.068）,IPGTT实验显示Rev-MKO小鼠葡萄糖耐量减弱。结论1.骨骼肌Rev-erbs特异性敲除小鼠模型构建成功。与Rev-erbα-/-小鼠模型不同,Rev-MKO小鼠昼夜进食量、自主运动、能量消耗、耗氧量及骨骼肌线粒体的功能无明显改变。骨骼肌Rev-erbs并不直接改变小鼠的自主活动量及线粒体功能。2.Rev-erbs直接调节骨骼肌糖脂代谢的转换。由于Rev-MKO小鼠骨骼肌糖酵解的能力减弱,脂肪酸β氧化能力增加,Rev-MKO小鼠肌力下降,在高强度运动时的运动耐力下降,而在中低强度运动时的运动耐力增加。3.骨骼肌Rev-erbs调控全身胰岛素敏感性及糖耐量水平。第二部分骨骼肌Rev-erbs调节糖脂代谢的机制研究目的探究骨骼肌Rev-erbs调节糖脂代谢的具体分子机制。方法1.通过提取WT及Rev-MKO小鼠胫骨前肌mRNA进行RNA-seq,通过差异基因分析、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析及 GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）分析,明确Rev-erbs主要调控的信号通路。重点分析葡萄糖、脂肪酸及氨基酸代谢通路相关基因的变化。2.通过提取WT及Rev-MKO小鼠股四头肌行代谢组学实验,对代谢产物进行差异分析,在MetaboAnalyst网站进行代谢组分分析,从代谢组学水平明确Rev-erbs主要影响的代谢通路。3.通过提取WT小鼠的肌肉组织进行ChIP-seq,分析Rev-erbα在肌肉组织作用的靶点,对检测到的Peaks在Great网站进行富集分析。结果1.RNA-seq结果显示,差异基因多富集在生物钟及代谢相关通路。骨骼肌Rev-erbs 敲除后,葡萄糖代谢、三羧酸循环相关基因的表达显著下调,脂肪酸 β 氧化、丙氨酸、支链氨基酸代谢相关基因的表达显著上调。2.代谢组学显示,Rev-erbs主要影响氨基酸、脂肪酸、TCA循环等代谢通路。3.ChIP-seq分析显示,Rev-erbα直接作用于调控糖脂代谢关键基因Acsll、Pdk4的转录起始位点。Great分析显示Rev-erbα在基因组结合的相关基因主要富集在生物钟、转录调控及代谢相关通路。结论1.Rev-erbs在肌肉主要影响节律基因及代谢基因的表达,Rev-MKO小鼠肌肉的葡萄糖代谢及三羧酸循环相关基因表达下降,脂肪酸β氧化及氨基酸代谢基因表达升高。2.代谢组学分析,Rev-erbs在骨骼肌中主要影响氨基酸、脂肪酸及三羧酸循环代谢通路。3.ChIP-seq提示Rev-erbα直接作用于一些糖脂代谢基因的转录起始位点,很有可能直接调控这些基因的转录表达。第三部分全基因组测序诊断糖脂代谢异常罕见病一例目的利用全基因组测序技术分析一例糖脂代谢异常罕见病患儿的致病突变,以明确诊断。方法1.抽取先证者一家三口的全血进行全基因组测序。2.利用CNVannotator注释并分析致病或可能致病的拷贝数变异（Copy number variation,CNV）。3.利用SnpEff注释并分析致病或可能致病的单核苷酸变异（Single nucleotide polymorphism,SNP）及 InDel（insertion/deletion）。4.利用Sanger测序分析验证可疑的致病突变。5.对可疑致病基因进行western blot,检测突变对蛋白水平的影响。结果1.根据 American College of Medical Genetics and Genomics（ACMG）及 Clinical Genome Resource（ClinGen）联合指南,未发现与该病例表型相关的致病或可能致病的CNV。2.根据 ACMG 指南,发现先证者PTEN（NM₀00314.4:p.Pro283fs/c.849delA）为致病突变。3.Sanger 测序验证了该 PTEN（NM₀00314.4:p.Pro283fs/c.849delA）位点的突变。4.Western blot显示先证者PTEN蛋白表达水平降低。结论1.先证者诊断为PTEN错构瘤综合征。PTEN该位点的突变造成蛋白编码提前终止,导致PTEN蛋白的C2结构域、C-terminus trail结构域异常或缺失,从而造成TI3K-AKT通路异常激活,胰岛素敏感性增加,葡萄糖利用过多,应激时常出现严重的低血糖。2.PTEN作为抑癌基因,能够抑制细胞增殖。PTEN生殖细胞突变可导致多种良性或恶性肿瘤的形成,该病例为PTEN生殖细胞突变造成脂质异常堆积形成的脂肪瘤。目前尚未有PTEN突变导致的严重低血糖合并巨大脂肪瘤的病例报道,该病例尚属首例。