大肠杆菌因其遗传图谱明确,培养费用低等优点而被广泛应用于外源蛋白的表达,但其所表达的蛋白经常形成无活性的包涵体。而包涵体具有很高的密度,呈非水溶性,只能溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。然后还需要缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构,这种变性再复性的过程并不能确保目的蛋白生物学活性的恢复。在我们实验室构建的几种PCV衣壳蛋白在大肠杆菌中均呈现了较高水平的可溶性表达。对蛋白结构分析发现其N端富含大量的精氨酸,推测这可能是导致其可溶性表达的原因。所以我们尝试将猪圆环病毒PCV2b的衣壳蛋白N端富含精氨酸的短肽(简称N41)作为蛋白抗原融合肽与表位重组蛋白进行融合表达,观察其在大肠杆菌中的表达形式。首先,我们通过PCR钓取N41编码基因,并将其与口蹄疫病毒的VP1蛋白的表位重组蛋白PO编码基因进行重组,构建p ET28a-N41-PO质粒,并在大肠杆菌表达系统中诱导表达。结果发现N41-PO在大肠杆菌中呈部分可溶性表达。通过镍亲和层析分离纯化得到目的蛋白N41-PO后将其与水包油乳化剂1:1混合免疫ICR小鼠,采用间接ELISA检测其血清中的抗体发现N41-PO免疫小鼠血清能够识别灭活口蹄疫病毒。初步说明N41短肽可以增强外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达,并且表达的融合蛋白具有较好的活性。为了进一步验证N41促进外源蛋白在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达的作用,我们构建了N41融合蛋白可溶性表达系统,将实验室中两种已经确定包涵体表达的New VP1和VP1OK93分别与N41进行融合表达,结果发现N41-VP1和N41-VP1 OK93均在大肠杆菌表达系统中实现了部分可溶性表达,且因未经历包涵体变性复性的纯化过程,外源蛋白可具有更好的免疫活性。以上结果说明N41确实可以促进外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,且表达的融合蛋白具有更好的免疫活性。但是分析N41融合蛋白在大肠杆菌中的表达量可知,几种蛋白在大肠杆菌中的表达量均不超过20%,并且N41-PO的表达量比PO降低了约50%。FMDV缅甸98株自2010年以来开始在亚洲多个国家开始大流行,被联合国粮农组织称为是近50年来最严重的一次,严重危害到我国养猪业的健康发展。为了能够获得针对FMDV缅甸98株的活性较好、安全性较高的疫苗,我们通过PCR获取了FMDV缅甸98株VP1蛋白的表位肽基因,利用N41融合蛋白可溶性表达系统构建了表位肽疫苗N41-H1。N41-H1在大肠杆菌中呈完全可溶性表达,纯化后免疫ICR小鼠,检测其免疫活性。结果显示N41-H1免疫小鼠血清对灭活口蹄疫病毒的识别作用较弱。为了增强构建的表位肽疫苗的免疫原性,我们将H1基因3次串联重复后,亚克隆至N41融合蛋白可溶性表达质粒中,构建新的表位肽疫苗N41-H3。免疫小鼠后检测其血清中抗体水平发现N41-H3免疫的小鼠血清可以更好地识别灭活口蹄疫病毒。综上所述,富含精氨酸短肽N41能够促进外源蛋白在大肠杆菌实现可溶性表达,并且表达的外源蛋白具有较好的活性,但是N41融合蛋白在大肠杆菌中的表达量偏低,还需要进一步完善。