光动力治疗(Photodynamic therapy，PDT)是利用光敏剂在光的激发下产生单线态氧(1O2)、活性氧自由基(ROS)等具高势能的化学活性分子，从而导致细胞死亡，达到治疗恶性肿瘤等疾病目的的重要手段。 亚甲基蓝(Methylene blue，MB)是一种吩噻嗪类结构的化合物，最大吸收波长为664nm，在光激发下，处于激发态的MB将能量传递给氧形成1O2和ROS。MB作为光敏剂，具有光敏期短、感光度高、不导致机体产生抗药性的优点。目前，关于MB—PDT抑制肿瘤的分子机制尚未深入阐明．因此，在本研究中，我们首次尝试整合多种生物学分析方法，从分子、细胞水平上来探讨MB—PDT诱导肿瘤细胞凋亡的机制。 本研究首先分析了MB—PDT对肿瘤细胞(Hela)的毒性效应。采用Hoechst荧光染色、AnneXin-V—PI双染色实验，在细胞水平上证实MB—PDT 能诱导Hela细胞凋亡。使用DHR123及DCFH-DA(ROS水平检测试剂)，发现PDT过程中，MB经光激发后产生的ROS是导致肿瘤细胞凋亡的主要因素。利用DiOC6荧光探针结合流式细胞分析，发现在MB—PDT 诱导细胞凋亡的过程中，线粒体跨膜电位(△Ψm)明显下降，显示在凋亡过程中，线粒体功能受到了影响。而且，以上这些效应都与MB药物处理剂量呈正相关。 为了研究MB—PDT引起肿瘤细胞凋亡的信号转导途径，我们首先运用蛋白组学分析方法，采用双向电泳、Ultraflex MALDI-TOF及MS/MS质谱鉴定，得到了MB—PDT 导致Hela细胞凋亡的细胞全蛋白分子差异表达谱。结果显示：MB—PDT过程中，线粒体内参与蛋白合成、电子传递、脂代谢、氧化压力调控等的相关分子水平都出现了明显下调。而与ERKs/MEK、cAMP—PKA途径的一些相关重要调控蛋白出现明显上调．以上结果说明了MB—PDT 激活细胞内源性凋亡途径，而与凋亡相关的上游功能蛋白ERKs及PKA参与了该过程的调控。 然后根据蛋白质组学分析提供的信息，我们进一步运用Western Blotting和免疫共沉淀方法从分子水平上进行验证分析。结果显示：MB—PDT 确实能使肿瘤细胞内PKA和ERK1/2的活化明显受到抑制，而抗氧化剂GSH则可显著逆转这种抑制状态。PKA、ERK1/2共同调控的下游蛋白Bad磷酸化也受到明显抑制，与Bad相结合的Bcl-xL则相应增加。同时，MB—PDT 能快速导致细胞色素C(cytc)释放，并引发死亡底物——聚腺苷二磷酸核糖体聚合酶(PARP)裂解，导致细胞凋亡发生。此外，我们还分析了细胞凋亡过程中，线粒体离子代谢水平的变化，结果表明[Ca2+]i水平发生明显上升。 综合本实验研究结果，推断MB—PDT 导致Hela细胞凋亡信号转导过程如下：MB首先经光激发产生的ROS，ROS促进抑制PKA、ERK1/2活化的相关蛋白表达上调，使PKA、ERK1/2的下游关键调控蛋白Bad磷酸化程度也受到抑制。去磷化的Bad可与抗凋亡蛋白Bcl-xL结合，导致线粒体外膜受损，释放出cyt c，使PARP裂解，启动凋亡的发生。 本研究不仅首次证实MB—PDT 能诱导Hela细胞通过依赖线粒体的内源性凋亡信号转导通路实现凋亡，而且探讨了其中一些关键节点分子的调控作用与方式。本研究结果有助于我们进一步了解PDT中，引导肿瘤细胞凋亡、死亡的机制，寻找可能的药物作用靶点，提高肿瘤治疗效率。并可为开发用于PDT的MB豕列衍生物、MB纳米药物提供了基本数据信息。