沙丁胺醇(salbutamol, Sal),又名咳喘宁,是一种β-肾上腺素受体激动剂,临床上广泛用于治疗支气管哮喘。同时,沙丁胺醇有促进蛋白质合成、增加动物胴体瘦肉率,营养再分配、提高饲料转化率的作用,常被非法作为饲料添加剂用于畜产品的生产,但是其残留对人类健康存在潜在危害。欧盟、美国、中国等国家和地区都先后立法禁止在畜禽生产中使用促动物生长的β-兴奋剂作为饲料添加剂。由于沙丁胺醇检测手段研究的相对滞后,而又与克仑特罗具有同样的促生长效果,正逐步取代克仑特罗,成为不法分子谋取经济利益的新手段。因此,建立快速、简单、方便、有效的检测SAL的方法,对确保食品安全具有重要意义。国内外已经建立了多种检测沙丁胺醇残留的理化检测方法,HPLC和GC-MS方法灵敏、精确,但由于设备昂贵、花费大、操作技能要求高等原因而不适合大批量样品的检测。酶联免疫吸附测定法可同时检测多个样品,具有灵敏、快速、特异性强、操作简单等优点,正逐渐应用于药物的残留检测。本实验运用化学合成方法制备SAL完全抗原,采用单克隆抗体技术和酶联免疫吸附测定等技术,研制针对SAL的单克隆抗体,初步建立了检测SAL的间接竞争酶联免疫吸附法(ciELISA)。加标回收试验证明,建立的检测SAL残留的ciELISA是稳定、可靠的。1.SAL完全抗原的合成与鉴定。通过SAL与琥珀酸酐的醇解反应制备SAL的琥珀酸衍生物,采用混合酸酐法和碳二亚胺法将其与载体蛋白BSA、OVA偶联,制备人工完全抗原SAL-BSA和SAL-OVA。通过紫外扫描初步判定两种完全抗原SAL-BSA、SAL-OVA偶联成功。2.SAL单抗的制备。用混合酸酐法合成的完全抗原SAL-BSA为免疫原免疫BALB/c小鼠,SAL-OVA为检测原。五免后阳性血清效价在1：10,000以上,采用杂交瘤技术获得1株可持续分泌针对药物SAL抗体的杂交瘤细胞株3G11。采用体内诱生法,将细胞株3G11接种到小鼠体内,制备了抗SAL的腹水。其蛋白浓度为20.8mg／mL,腹水效价为1：32,000。3.ELISA检测方法的建立。用3G11杂交瘤细胞株制备的小鼠腹水做出SAL药物抑制标准曲线,其线性方程为：y=0.2618x+0.0493(R2=0.9862),IC50为53ng／mL,LOD为2ng／mL,LOQ为16.7ng／mL。交叉实验表明,该单抗与莱克多巴胺的交叉反应率在0.1%以下,与盐酸克伦特罗交叉反应率在38%。4.添加回收实验。将建立的CiELISA初步应用于猪肝添加回收试验。当猪肝样品液做4倍以上稀释,基质干扰基本消失,且在0-1600ng／mL范围内,标准曲线的线性方程Y=0.295x-0.0633,R2=0.9829,IC50为81.28ng／g,LOD为3.68ng／g。用5、20、50、100、200和400ng／mL的沙丁胺醇标准液做添加回收试验,经检测猪肝组织中回收率在75%～100%之间,批内差异在2.98%～10.34%之间,批间差异在2.61%～12.47%之间。