论文部分内容阅读
锌是人体必需的营养素,与人类健康息息相关,体内锌紊乱会导致多种疾病的发生,如肿瘤。临床研究发现,肿瘤患者体内缺乏锌,存在多种锌转运蛋白表达异常,膳食补锌具有抑制肿瘤作用,但具体的分子机制仍不清楚。癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中数据显示,人类多种肿瘤组织锌转运蛋白Zn T7表达量下降,但无相关机制研究。本课题以此为契机,探究营养素锌对肿瘤发生发展的影响及其作用机制,旨在为延缓肿瘤发生进程和功能性食品开发提供一定的理论基础支持。果蝇是经典的遗传模型,超过75%的疾病基因与人类高度同源。近年来已广泛用于肿瘤相关基因筛选和膳食营养与健康相关领域的研究。Zn T7定位于高尔基体上,负责将细胞质内锌转运至高尔基体内,本课题发现Zn T7基因沉默（dZnT7RNAi）会加重遗传性良性肿瘤模型Ras V12和恶性肿瘤模型Raf GOFscrib-/-肿瘤表型;进一步利用生物化学、分子生物学的方法深入探讨细胞内锌水平变化影响肿瘤发生发展的机制。结果显示,体内锌紊乱通过调控JNK依赖的自噬途径影响肿瘤进程。基于此分子机制,寻找能够调控JNK途径影响肿瘤进程的天然植物生物活性物质,发现黑豆皮提取物（black bean skin coat extract,BBSCE）及其花青素活性单体矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside chloride,C3G）能通过JNK信号通路调控肿瘤及其微环境,进而发挥抗肿瘤效果。本课题主要研究内容和结果如下:（1）dZnT7沉默促进肿瘤生长和侵袭。良性肿瘤Ras V12细胞中沉默Zn T7会导致肿瘤组织过度生长;恶性肿瘤Raf GOFscrib-/-细胞中沉默dZnT7能够明显促进肿瘤生长、侵袭和远处转移,并且肿瘤转移标志蛋白MMP1表达增加近一倍（P<0.001）。（2）体内锌稳态与肿瘤生长密切相关。与野生果蝇w1118相比,恶性肿瘤模型Raf GOFscrib-/-果蝇体内锌水平下降了35%（P<0.001）;而dZnT7 RNAi;RafGOFscrib-/-果蝇体内锌水平又进一步降低了15%（P<0.05）。说明肿瘤的发生发展与体内缺锌密切相关。进一步研究发现膳食补锌能够抑制肿瘤生长,延缓肿瘤发生进程。（3）dZnT7沉默通过激活JNK信号促进肿瘤生长发育。在肿瘤细胞中沉默dZnT7能够明显增加磷酸化JNK（p JNK）表达（～90%,P<0.001）,并且JNK下游的肿瘤侵袭标志蛋白MMP1表达明显升高（～175%,P<0.01）;过表达JNK抑制蛋白Bsk DN,阻断JNK信号能够明显抑制dZnT7 RNAi;Raf GOFscrib-/-肿瘤生长和侵袭,降低p JNK以及MMP1蛋白表达水平。说明dZnT7沉默通过激活JNK信号通路促进肿瘤生长、侵袭和远处转移行为。（4）dZnT7沉默引起的高尔基体锌紊乱激活了JNK信号通路。发现dZnT7RNAi能够增加JNK下游基因puc G464表达（～43%,P<0.01）,说明沉默dZnT7能够激活JNK信号。机制研究发现,dZnT7 RNAi引起高尔基体内锌离子缺失,利用遗传手段挽救其高尔基体内锌紊乱,能完全抑制JNK激活,说明沉默dZnT7可能引起了高尔基体内锌紊乱,激活JNK信号通路,从而加重肿瘤表型。（5）dZnT7沉默通过JNK依赖的自噬途径促进肿瘤生长发育。发现dZnT7RNAi能激活细胞自主性和非自主性自噬,增加了肿瘤组织自噬水平（～25%,P<0.05）;利用遗传手段阻断JNK信号,能够明显抑制dZnT7 RNAi引起的自噬增强,挽救肿瘤加重表型。（6）BBSCE及其花青素单体C3G通过阻断JNK依赖的自噬途径抑制肿瘤生长。体外细胞实验表明C3G具有调控JNK作用,但在体内及其对肿瘤微环境的影响仍不清楚。结果表明BBSCE或C3G能够延长肿瘤果蝇生存时间,抑制肿瘤生长、侵袭和远处转移行为。进一步研究发现C3G可能通过阻断JNK依赖的肿瘤细胞自主性自噬和微环境自噬途径,抑制肿瘤生长发育。基于上述机制的研究,为了进一步推广C3G在肿瘤防治的临床应用,将C3G与抗肿瘤药物氯喹（chloroquine,CQ）联用,结果发现C3G与CQ联用的抗肿瘤效果要明显优于C3G或CQ单独使用,肿瘤生长和侵袭均明显抑制,说明C3G能够协同增效CQ抗肿瘤效果。综上,本课题借助果蝇肿瘤模型,发现dZnT7 RNAi引起高尔基体内锌紊乱,激活了JNK信号,进而增强细胞自主和非自主性自噬,加速肿瘤进程;而膳食补锌能够明显抑制肿瘤生长发育。此外,BBSCE及其功能分子C3G能明显抑制肿瘤生长,并且C3G能辅助临床抗肿瘤药物CQ,增强其抗肿瘤效果。本工作提供了体内证据表明摄入膳食营养因子锌和黑豆皮提取物能够缓解肿瘤表型,这不仅可作为肿瘤病人日常膳食和营养调节的指导,也为功能性食品的开发提供了一定的理论支持。