濒危植物长序榆遗传多样性及对水分适应性研究

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长序榆(Ulmus elongata),属于榆科植物,是1979年发现的一个榆属新种,落叶乔木,为国家Ⅱ级重点保护植物。由于受环境变迁和人类活动的影响,长序榆的生境出现严重的片段化,种群规模和种群内个体的数量逐渐减少,因此必须要开展对长序榆种群濒危原因的研究,以期为制定合理和有效的保护措施提供依据。本文从宏观和微观两个方面,在分子生物学和植物生理学的基础上对长序榆进行了研究。通过ISSR标记技术,对长序榆种群的遗传多样性和遗传变异进行研究,探讨种群间的遗传结构和种群间的基因交流,从微观方面阐明长序榆濒危的原因;并从生理学的角度来研究外界环境尤其是水分胁迫对长序榆生长的影响,从宏观方面阐明环境改变对长序榆的正常生长造成的影响,揭示长序榆对不同环境条件的适应过程和对策,以期对长序榆保护策略的制定提供一定的科学依据。主要研究结果如下:1、通过单因素试验和正交试验两种方法对影响长序榆ISSR-PCR反应的反应程序和反应体系进行了优化,最终确定长序榆ISSR-PCR的反应程序为:94℃预变性3min,94℃变性30s,特定退火温度下(随引物不同而设定)退火30s,72℃延伸60s,共35个循环,然后72℃延伸10min,4℃保存。反应体系总体积为25μl,其中包括:2.5μl Buffer(含Mg2+),50ng模板DNA,1.2μmol/L引物,0.2mmol/L dNTPs和2.5U的Taq酶。其中Taq酶对ISSR-PCR的影响最为显著,其次为引物浓度,dNTPs对PCR的影响最小。并利用优化好的反应程序和反应体系成功筛选了11条ISSR引物用于长序榆遗传多样性的研究。2、利用11条ISSR引物对7个长序榆种群的遗传多样性和遗传分化进行了研究。结果表明:11条引物共扩增出了85条条带,其中70条条带为多态性条带,多态性百分率(PPB)介于33.33%-100%之间。在物种水平上,长序榆的遗传多样性较高(PPB=82.35%,I=0.3959,H=0.2585);在种群水平上,长序榆的遗传多样性则较低(PPB=29.07%,I=0.1733,H=0.1191)。种群间的遗传分化系数(Gst=0.3682)表明,长序榆种群已经产生了遗传分化,并且种群间的遗传分化小于种群内,AMOVE分析验证了这一结论,并进一步证明了在长序榆种群之间和种群内部都产生了显著的遗传变异(P<0.001)。基因流Nm为0.858,这说明长序榆种群间基因交流程度有限,这是导致长序榆种群产生遗传分化的最主要原因。UPGMA聚类分析表明:长序榆的7个种群可以分成2支,其中福建南平(FJNP)单独一支,浙江临安(ZJLA)和安徽歙县(AHSX)、浙江松阳(ZJSY)和浙江遂昌(ZJSC)先聚在一起,然后与浙江开化(ZJKH)和江西武宁(JXWN)聚在一起。Mantel检验表明长序榆各种群间的遗传距离与地理距离间存在极显著的正相关性(r=0.7015,P=0.007)。3、以福建南平引种回来的长序榆幼苗为试验材料,设置七个处理水平:对照组(CK)、轻度干旱(T1)、中度干旱(T2)、重度干旱(T3)、饱和状态(T4)、轻度水涝(T5)、中度水涝(T6),研究不同的水分条件对长序榆幼苗脂质过氧化及抗氧化系统的影响。研究发现,水分胁迫初期,与对照组相比长序榆幼苗体内的细胞质膜透性、MDA含量和·OH含量呈上升趋势,但是变化不明显,叶绿素含量、Fo、Fm、 Fv/Fm、ETR、Yield等有所下降,同时长序榆幼苗体内的保护系统开始发挥作用,POD、 SOD活性有所上升,植物体清除活性氧的速率较快,Pro和可溶性糖含量也呈上升趋势,有效降低了细胞的渗透势,保证了膜系统的稳定性,为了防止光氧化对自身造成的伤害,NPQ上升,即光能转化为热能的比例升高。随着水分胁迫的持续,长序榆幼苗自身的防御系统不能够阻止活性氧对植物体造成的伤害,POD、SOD活性开始下降,Pro和可溶性糖含量上升,而细胞质膜透性、MDA含量和·OH含量显著上升,NPQ也呈上升趋势,叶绿素含量、Fm、Fv/Fm、ETR、Yield等持续下降,中度干旱和重度干旱在第20天时Fo有所上升,可能是产生了不可逆失活,此时使活性氧的增加超出了细胞的清除能力,导致活性氧积累增加,使得膜脂过氧化作用加重。在水涝胁迫初期,细胞质膜透性、MDA、·OH含量在处理前期随着水涝胁迫的加深还会低于对照组水平,叶绿素含量、Fo、Fm、Fv/Fm、ETR、Yield、NPQ都有所上升,这说明长序榆更适宜生长在较湿润的环境中。灰色关联度分析发现,水分对叶绿素荧光参数的影响较大,其次是SOD,说明长序榆幼苗的光合作用对水分的缺失较敏感。通过隶属函数分析可知,长序榆幼苗更耐涝,对不同土壤含水量的适应程度依次为:饱和状态>对照组>轻度水涝>中度水涝>轻度干旱>中度干旱>重度干旱。
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