目的： 体外分离培养兔B型滑膜细胞(type B synoviocytes)，构建转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF—β1)的重组真核表达载体pcDNA3.1-TGF—β1质粒，用脂质体法将该质粒转染兔B型滑膜细胞，将转染后细胞复合Pluronic—F127在裸鼠体内构建组织工程软骨，观察转染后细胞体内向软骨组织方向分化的可行性，为基因加强组织工程学修复软骨损伤提供实验依据。 方法： 1、取3月龄健康新西兰大白兔，雌雄不限，耳缘静脉注射空气处死，严格消毒下，迅速开腹切取小块肝脏组织，置入冻存管，立即投入液氮中冷冻备用；同时打开膝关节，用眼科镊撕取关节腔内面的滑膜组织，将术中取到的组织迅速带入无菌室，分别应用酶消化法行滑膜细胞体外培养扩增，贴壁筛选、单一胶原酶消化和多次传代法相结合行纯化培养，同时进行抗Vimentin、抗CD68免疫组化鉴定细胞。 2、取出液氮中冷冻的肝脏组织，研磨成粉末，Trizol法提取总RNA，分析TGF—β1mRNA序列，设计引物，用cDNA合成试剂盒合成cDNA，并行二次PCR扩增；将带有pcDNA3.1(+)的菌株行扩增、摇菌、抽质粒，将扩增后的TGFβ1cDNA和pcDNA3.1(+)进行酶切，将目的片段连接载体，转化E．coli DH5α感受态细胞，鉴定转化菌，Amp筛选，对阳性菌克隆提质粒，进行酶切鉴定，将阳性菌液送测序鉴定。 3、转染前一天，取第三代滑膜细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，接种于6孔板，每孔细胞数为2×105，待细胞生长至80％融合时，按lipofectamine2000试剂盒说明行pcDNA3.1-TGFβ1质粒转染，同时取另一6孔板行pcDNA3.1(+)空质粒转染，上述两组分别为实验组和对照组，以软骨细胞为阳性对照组。实验组、实验对照组转染后48小时行G418筛选阳克隆，每两天取部分细胞做细胞计数，连续12天，绘制细胞生长曲线，取部分阳性细胞行RT—PCR检测TGF—β1、Ⅱ型胶原、糖氨多糖的瞬时表达，对RT—PCR结果用ScnImage软件分析处理，计算相对灰度值，所有实验数据使用SPSS13.0行统计学处理，各间两两比较，采用方差分析，P值<0.05有统计学意义；另取部分阳性细胞做细胞爬片，4％多聚甲醛固定后行TGFβ1、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。 4、在4℃将Pluronic—F127溶解，配成质量分数为20％液体，然后与转染后稳定表达的细胞进行混合，同时取软骨细胞混合Pluronic—F127、空载体转染细胞混合Pluronic—F127作为对照组，各组细胞浓度均为5×107/mL的复合物，迅速以0.2ml注射器行裸鼠背部皮下注射，分别在术后4、6、8周处死实验裸鼠，取出裸鼠背部组织进行大体标本观察后，制成5μ m厚切片，切片行苏木素—伊红(HE)染色光镜下观察骨组织及软骨组织形成情况，同时进行抗Ⅱ型胶原、抗TGF—β1免疫组织化学检测。 结果： 1、兔滑膜来源的B型细胞体外分离培养，细胞呈梭形和多角形，活性良好，细胞可传代10代而无明显退变迹象，进行免疫组化鉴定，抗Vimentin为阳性、抗CD68为阴性，可与A型滑膜细胞鉴别。 2、成功构建真核表达载体pcDNA3.1-TGFβ1，质粒酶切后电泳显示有pcDNA3.1和TGFβ1片段，测序结果完全符合TGFβ1 DNA序列。 3、脂质体法转染后，生长曲线显示转染后细胞生长活性较阳性对照组降低，实验组细胞转染后第3天，RT—PCR检测到TGFβ1、Ⅱ型胶原、糖氨多糖阳性片段，实验对照组为阴性；细胞转染后第4天至3周，抗TGF—β1、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色实验组可见细胞内阳性颗粒，对照组为阴性。 4、分别在4、6、8周处死实验裸鼠，取出各组裸鼠背部组织进行大体标本观察，见实验组以及软骨细胞混合Pluronic—F127组可形成透明软骨样组织，抗Ⅱ型胶原、抗TGF—β1免疫组织化学检测均为阳性，在空载体转染细胞混合Pluronic—F127组均未见软骨样组织形成，免疫组化结果为阴性。 5、统计分析显示，转染后各组RT—PCR结果显示转染后TGFβ1、Ⅱ型胶原及糖氨多糖表达高于空载体组，差异有统计学意义，实验组与阳性对照组之间的差异无统计学意义。 结论： 脂质体法重组pcDNA3.1-TGF—β1基因转染的兔B型滑膜细胞，可表达TGF—β1，细胞分泌Ⅱ型胶原和糖氨多糖，表现出软骨细胞样生理特征，并在3周内未见明显减退，裸鼠体内实验显示转染后细胞混合Pluronic—F127在8周时可形成类软骨样组织；B型滑膜细胞具有向软骨样细胞分化的潜能，在体内外可保持软骨细胞表型，为软骨组织工程提供了一种新的种子细胞。