【摘 要】
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遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（Genetic epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+）是一种遗传性的癫痫综合征,具有临床表型及基因型异质性。虽然目前研究显示GEFS+病因与遗传有关,但许多GEFS+的病因仍未明,需进一步探索。我们在前期研究的基础上进一步扩大GEFS+家系进行基因检测,发现一个新基因变异即KCNT1 R706Q变异,基因致病性评估表明可能导
【基金项目】
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广州市科技计划项目（201510010189）； 广州市科技计划项目,202002030428,遗传性癫痫伴热性惊厥附加症钾离子通道致病基因的捕获及KCNT1基因突变致病机制研宄,2020/4-2023/3,20万；
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遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（Genetic epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+）是一种遗传性的癫痫综合征,具有临床表型及基因型异质性。虽然目前研究显示GEFS+病因与遗传有关,但许多GEFS+的病因仍未明,需进一步探索。我们在前期研究的基础上进一步扩大GEFS+家系进行基因检测,发现一个新基因变异即KCNT1 R706Q变异,基因致病性评估表明可能导致蛋白质功能受到影响,推测KCNT1可能是GEFS+的新的致病基因。拟对KCNT1 R706Q变异进行细胞功能学的验证,为GEFS+的病因及精准治疗提供新的理论依据。研究对象及方法收集2014年10月～2019年10月于广东省人民医院诊治的GEFS+家系,收集研究组GEFS+家系40个。应用二代测序全外显子测序技术对研究组的先证者进行基因分析。采用Sanger测序技术对KCNT1变异进行对照组200例健康人群验证。构建KCNT1 R706Q与KCNT1野生型（Wt）质粒,用慢病毒进行包装,然后转染HEK293细胞,通过RT-PCR测定两组mRNA水平表达,Western blot测定两组蛋白水平表达。构建KCNT1 R706Q与KCNT1 Wt钾通道,用奎尼丁 100 μM进行干预,通过全细胞膜片钳分别比较奎尼丁干预前两组达电流峰值50%的时间差异、奎尼丁干预前后两组电流密度的差异。结果1.40个GEFS+家系中,21个家系发现致病或可能致病的基因变异,包括SCN1A 变异、SCN3A 变异,SCN9A 变异、KCNQ4 变异、KCNAB3 变异、KCNT1变异,GABRD变异、GPR98变异。3个家系发现意义不明的基因变异,包括KCNQ3 变异、CACNA1A 变异、CACNA1H 变异。2.发现2个新的KCNT1变异R706Q、R1137H,国内外未见报道。200例健康人群中均未发现该变异。3.RT-PCR:KCNT1 R706Q与KCNT1 Wt慢病毒均在mRNA水平有效表达。4.Western blot:KCNT1 R706Q与KCNT1 Wt慢病毒均在蛋白水平有效表达。5.膜片钳:KCNT1 Wt、KCNT1 R706Q钾通道电流约在-80mV开放,当电压达到60mV时通道电流达到峰值。阶跃刺激中,KCNT1 R706Q组电流密度（58.42±18.28 pA/pF）大于 KCNT1 Wt 组电流密度（39.96±6.31 pA/pF）,P 值0.2575,无统计学差异。KCNT1 R706组达电流峰值50%的时间（0.1096±0.0066s）小于KCNT1 Wt组（0.1566±0.0059s）,P=0.0001,差异有统计学意义。时间-电压曲线显示,KCNT1 R706Q组曲线右移。奎尼丁 100μM干预后,KCNT1 Wt组的电流密度（10.75±1.71 pA/pF）较干预前（39.96±6.31 pA/pF）显著减少;KCNT1 R706Q 组的电流密度（14.24±2.18pA/pF）较干预前（58.42±18.28 pA/pF）显著减少,两组P值均＜0.0001。电压达60mV时,KCNT1 Wt组奎尼丁干预后的电流密度（29.67±5.65 pA/pF）较干预前（154.34±24.64pA/pF）显著减少,P＜0.0001;KCNT1 R706Q组奎尼丁干预后的电流密度（37.74±7.22 pA/pF）较干预前（249.26±68.99pA/pF）显著减少,P=0.008。结论1.40个GEFS+家系中,发现SCN1A基因（9个家系）、SCN9A基因（1个家系）、GABRD基因（1个家系）存在新的变异位点。2.首次在2个GEFS+家系中发现KCNT1新的杂合错义变异,即R706Q及R1137H。3.KCNT1 R706Q变异引起功能改变,为功能获得性变异。KCNT1可能是中国人群GEFS+的新的致病基因。
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