我国最早开始报道PCV2的感染和流行是在2001年,迄今已经在我国养猪行业中普遍存在,对我国养猪业的发展造成严重影响。PCV2广泛流行于全世界范围。在PCV2预测的11个蛋白中文献报道被鉴定的五个蛋白是ORF1-5。本实验室前期鉴定了新的ORF6基因。ORF6基因（核苷酸序列1611-1522bp,共90bp）重叠于ORF2,编码30个氨基酸,其分子量预测为2.8kDa。本课题主要分析和研究了PCV2 ORF6在PCV2致病性中的生物学作用。重点研究了ORF6在PCV2复制中的作用、对ORF1⁴的影响、ORF6介导的细胞凋亡以及动物体内致病性实验等方面揭示ORF6基因对PCV2复制感染的影响及在PCV2致病性中的作用。主要研究内容及结果如下:1.病毒的增殖以及ORF6对ORF1-4 mRNA的作用之前本实验室已经成功构建了PCV2野生型和ORF6缺失突变型感染性克隆,并获得了PCV2重组野生型病毒W-2PCV2及ORF6基因缺失突变型病毒M-2PCV2。将M-2PCV2和W-2PCV2调整为同一MOI,利用荧光定量PCR方法检测病毒增殖情况。通过一步法增殖曲线发现M-2PCV2的增殖滴度低于W-2PCV2。表明ORF6影响PCV2在体外的增殖水平。进一步探究了ORF6对ORF1-4 mRNA转录的影响。将M-2PCV2和W-2PCV2分别接种PK-15细胞,分别于感染后不同时间收集感染细胞,提取细胞总RNA。分别利用特异性的ORF1⁴引物,实时荧光定量PCR检测,发现M-2PCV2和W-2PCV2的ORF1、ORF2、ORF3和ORF4 mRNA拷贝数无明显差异。表明PCV2 ORF6基因对ORF1、ORF2、ORF3和ORF4的转录水平无明显作用。2.ORF6介导的细胞凋亡使用ORF6表达质粒转染无PCV污染的PK15细胞,于转染后不同时间收集细胞样品,检测凋亡相关caspase家族的caspase 3、8和9的激活情况,结果ORF6基因不能激活caspase3、8和9。同时利用Annexin V-PI双染法检测凋亡细胞。发现ORF6基因也不能诱导细胞凋亡。而将PCV2重组野生型病毒W-2PCV2及ORF6基因缺失突变型病毒M-2PCV2同时感染PK15细胞,检测Caspase 3、8和9的活性,发现ORF6缺失株可以上调caspase 3的活性,下调caspase 8的活性。3.动物致病性实验分别将10⁴.0.0 TCID₅₀ W-2PCV2和M-2PCV2重组病毒攻毒感染Balb/c小鼠,并同时设立同样剂量感染的PCV2野毒对照和DMEM空白对照。于感染后每天观察感染小鼠的临床症状。并于攻毒感染后0、7、14、28、42天时采集攻毒小鼠血清,分别检测IFN-β、IL-4、RANTES、IL-8、IL-10等的表达。同时,随机处死不同感染组的3只小鼠,采集攻毒小鼠的肺、脾、肝和腹股沟淋巴结组织器官,检测其各组织病毒载量,并制备成组织切片。分别观察和分析不同病毒感染小鼠导致的组织病理学变化。揭示和分析ORF6基因在PCV2体内感染致病性中的作用。结果观察到实验组和对照组的小鼠在整个动物试验期间,临床症状均无明显变化。分别于攻毒感染后7、14、28、42天时采集攻毒小鼠血清,荧光定量分析和检测不同时间点血清中细胞因子的表达水平,结果发现W-2PCV2感染小鼠血清中的IFN-β、IL-4、RANTES、IL-8和IL-10的细胞因子水平在不同时间点均显著高M-2PCV2诱导的相应的细胞因子水平,表明ORF6可以显著提高IFN-β、IL-4、RANTES、IL-8和IL-10的表达水平。分别在不同的时间点采集攻毒小鼠的不同血清和组织样品,通过实时荧光定量检测病毒载量,结果M-2PCV2感染小鼠的血清和肝、脾、肺和腹股沟淋巴结的病毒载量均高于W-2PCV2感染小鼠。表明ORF6基因可以降低感染小鼠体内的病毒载量水平。另外,分别在不同的时间点采集实验组和对照组小鼠的腹股沟腹股沟淋巴结、脾脏、肝脏和肺部样品,制备组织切片,通过HE染色观察病理变化,结果M-2PCV2、W-2PCV2和PCV2野毒感染实验组的小鼠的脾脏和腹股沟淋巴结组织内的淋巴细胞减少,生发中心扩张,以组织细胞及淋巴母细胞为主的增生。肝脏的肝细胞变性,有散在肝细胞坏死。M-2PCV2组的小鼠病理变化最明显,脾脏和腹股沟淋巴结淋巴细胞消失更多。同时,M-2PCV2组的小鼠肺脏有大量的嗜中性粒细胞和单核细胞浸润,肺泡间隔增厚更多,出血更严重,组织内的红细胞更多。在小鼠体内,ORF6缺失株M-2PCV2表现出更强的致病性,表明ORF6与PCV2的毒力及致病性紧密相关。其在本动物猪体内的参与毒力调控作用还有待进一步研究。