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目的胰岛素是治疗糖尿病的支柱性药物。截止目前,注射给药依然是胰岛素临床应用唯一的给药方式。糖尿病患者通常需要长期甚至终身服药,长期注射给药最主要的问题是使用不方便,患者顺应性差,使用不当很容易导致低血糖症,注射给药还可带来皮下脂肪萎缩、皮下硬结等不良反应。因此研发胰岛素非注射给药制剂始终是抗糖尿病药物研发领域的重点和热点。非注射途径胰岛素制剂的研制主要包括肺吸入剂、口服制剂、黏膜给药制剂。其中口腔颊黏膜给药制剂以其突出的优势,受到研究者的关注。颊黏膜吸收表面积大,通透性良好,蛋白酶活性较低,血管丰富,是肽类药物较适合的给药途径;颊黏膜给药可避免肽类药物在胃肠道的降解和在肝脏的首过效应;口腔黏膜递药系统方便给药,且病人易于接受,具有较高的顺应性。然而,由于胰岛素分子量较大(MW6000),正常生理条件下很难透过口腔黏膜并吸收入血,因此如何提高胰岛素在颊黏膜处的通透性,是研发胰岛素口腔颊黏膜制剂首先需要解决的关键问题。本课题的研究目的是筛选安全高效的口腔黏膜促渗透吸收剂,优化胰岛素口腔黏附片的制剂配方,摸索胰岛素口腔黏附片的制备工艺,旨在为研制新型胰岛素口腔颊黏膜给药制剂奠定基础。方法:1.口腔黏膜上皮细胞渗透转运模型的建立:应用TR146细胞系,采用Millicell插入式细胞培养皿,建立TR146细胞三维培养模型。通过检测培养不同时间的TR146细胞层电阻值,评估TR146细胞层的生长状态;建立胰岛素高效液相色谱(HPLC)检测方法,用培养4、8、12、16、20、24、28、32d的细胞模型研究胰岛素的渗透转运特点,以评价TR146细胞层的完整性。2.促渗透吸收剂的体外筛选:利用TR146口腔黏膜上皮细胞模型,研究不同浓度的促渗透吸收剂NAC、SDC、SNP、GSH、Gln、CS、Arg、Azone和SPC,对胰岛素经TR146口腔黏膜上皮细胞渗透转运的影响,采用HPLC法检测胰岛素的渗透转运量,计算相应的胰岛素表观渗透系数(apparent permeability coefficient, Papp)和促渗比(enhancement ratio, ER);并用MTT方法研究不同浓度的促吸收剂对TR146细胞活力的影响,计算细胞相对酶活性,以评价各促吸收剂的细胞毒性。通过综合评价筛选出安全高效的促渗透吸收剂。3.胰岛素口腔黏附片的制备及体外特性的研究:以CS、AP、CP、HPMC、CMC-Na和SA为黏附材料,设计12个处方F1-F12,制备口腔黏附片,每片重82 mg,含胰岛素2 mg。采用冷冻干燥法制备胰岛素口腔黏附片黏附层,然后在黏附层一面添加防水层,防水层由疏水性物质10%乙基纤维素溶液组成,室温晾干后即得胰岛素口腔黏附片。观察各组处方外观特征,测定各组处方黏附片质量、体外黏附力、溶胀百分率和体外释放度,综合评价各处方的优劣。结果:1. TR146口腔黏膜上皮细胞渗透转运模型的建立:? 2-6 d细胞TEER值呈直线上升,6-24 d细胞TEER值缓慢上升,24-30 d细胞TEER值升至最高并到达平台期,此时细胞TEER值约为129.4±9.7 ??cm2 (n = 50)。?对照组胰岛素渗透速率和最终累积渗透量最大,30 min和240 min时其累积渗透量分别为1591.95±104.29μg、2449.91±129.52μg。随着培养时间的增加,4、8、12、16、20、24 d组的渗透速率和最终累计渗透量逐渐减小。28 d组和32 d组渗透速率更慢,最终累积渗透量分别为248.56±93.11μg、177.29±59.52μg,表明此时细胞层已趋于稳定,可用于渗透吸收实验研究。2.促渗透吸收剂的体外筛选:?单独促吸收剂5% NAC、SDC、GSH、CS、Arg,Azone、SPC、SNP,1% SNP,及混合促吸收剂5% CS/5% Azone、5% CS/1 % Azone、5% SPC/1% CS、5% SPC/1% Azone,均可显著促进胰岛素经口腔上皮细胞的渗透转运,与对照组相比均有统计学意义(P<0.05);? MTT结果表明1 % SDC、Arg组、5% Gln、Azone、SDC、SNP、Arg组和5% CS/5% Azone组均显著降低TR146细胞的相对酶活性,与对照组相比,具有统计学差异(P<0.05)因而对细胞有较大毒性,而其余各组的细胞酶活性变化不显著,对细胞的毒性较小,可用于下一步研究。3.胰岛素口腔黏附片的制备及体外药学特性的研究:?冻干法制备的胰岛素口腔黏附片有多孔海绵状结构,利于胰岛素的释放,具有疏水的保护层,可保证药物单向释放,避免了药物的损失;? F5、F7和F12组成形性差,未作进一步研究。其余各组黏附力检测结果为F6(137.97±7.33 g/cm2)>F8>F11>F1>F9>F4>F10>F3>F2(66.1±6.65 g/cm2);各组溶胀速率大小顺序为F6>F11>F8>F1>F4>F3>F10>F9>F2;体外释放度结果为F2、F9和F10胰岛素累积释放量较大。结论:1.建立TR146口腔黏膜上皮细胞渗透转运模型,该模型稳定可靠,重复性好,简单易行,可用于研究口腔黏膜递药系统药物渗透转运的体外模型。2.筛选评价确定5% NAC、GSH、CS、SPC,1% SNP,5% CS/1% Azone,5% SPC/1% CS和5% SPC/1% Azone等促吸收剂促进胰岛素渗透转运效果可靠,均可作为安全有效的候选促吸收剂,用于胰岛素口腔给药制剂的开发。3.以AP为主要黏附材料的F2和以CP为主要黏附材料的F9、F10处方制备的胰岛素口腔黏附双层片,具有适宜的生物黏附性、良好的溶胀率和体外释药特性,可用于下一步研究。