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背景与目的动脉粥样硬化,作为诸多缺血性心脑血管疾病的共同病理基础,无声的侵蚀着人类的健康和生命,给千千万万的家庭乃至整个社会带来了沉重的经济负担。动脉粥样硬化病变可以看成是多数慢性疾病状态和少数急性心脑血管事件的一个结合体,“心血管代谢疾病”一词很好的概括了这一特点。既然在发生或即将发生急性事件的晚期加以强化药物或介入干预较为被动,不如在慢性代谢紊乱出现的早期加以及时治疗,从根本上改善动脉粥样硬化病变形成的病理基础。本研究欲观察并评价一种临床具有潜在抗动脉粥样硬化疗效的中药复方颗粒剂——调脂通脉颗粒对于斑块病变的治疗效果,并从斑块巨噬细胞胆固醇分解和转运的脂质代谢角度,阐释调脂通脉颗粒治疗动脉粥样硬化的药理机制。方法1.实验一：将15只兔随机分为球囊损伤组(n=8)和假手术组(n=7),通过大体标本观察、苏丹Ⅳ染色和组织切片H&E染色,并计算内膜增生面积百分比、平均内膜厚度百分比和最大内膜厚度百分比以及判断脂质核心是否存在,来评估在高脂饮食基础上应用颈总动脉球囊损伤法所形成的兔动脉粥样硬化病变情况。2.实验二：将56只兔随机分为4组(n=14)：正常组、模型组、中药组和他汀组,正常组喂以正常饮食,其余3组兔行颈总动脉球囊损伤结合高脂饮食以建立兔动脉粥样硬化模型,中药组和他汀组兔分别以调脂通脉颗粒(7.3g/kg/d)和阿托伐他汀(1.1mg/kg/d)灌胃给药,正常组和模型组仅灌以蒸馏水,分6周和12周两个时间点进行观察评价。通过组织切片H&E染色观察并计算内膜增生面积百分比和最大内膜厚度百分比来评价药物对斑块病变的治疗效果；通过免疫组织化学染色法检测兔颈总动脉和胸主动脉巨噬细胞以及肝脏细胞的三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白表达水平,并计算斑块巨噬细胞ABCA1蛋白阳性表达的平均光密度值和肝小叶ABCA1阳性肝细胞比率,同时,通过观察免疫组织化学法染色的斑块巨噬细胞对TUNEL法标记凋亡细胞的吞噬即胞葬作用的情况,从脂质跨膜转运和炎症的角度来探讨调脂通脉颗粒治疗动脉粥样硬化的机制。3.实验三：将120只ApoE1-/-小鼠随机分为3组(n=40)：对照组、中药组和他汀组,均采用单纯高脂饮食法建立动脉粥样硬化模型,中药组和他汀组小鼠分别以调脂通脉颗粒(16.5g/kg/d)和阿托伐他汀(5.1mg/kg/d)灌胃给药,对照组仅灌以蒸馏水,分8周和16周两个时间点进行观察。通过荧光共聚焦测定小鼠主动脉斑块内脂质染色剂BODIPY与自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)、BODIPY与溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)的共定位情况并计算相应Pearson共定位系数,以评价药物对斑块巨噬细胞脂质自噬能力的影响情况,从脂质分解代谢角度探讨药物治疗动脉粥样硬化的机制；同时,通过Western Blot检测小鼠主动脉组织LC3、ULK1、磷酸化ULK1(Ser317)、AMPKα磷酸化AMPKa(Thr172)蛋白表达水平,并计算LC3-Ⅱ:L C3-Ⅰ蛋白含量比值、磷酸化ULK1(Thrl72):总ULK1蛋白比值和磷酸化AMPKα(Ser317):总AMPK蛋白比值,以明确药物调控自噬功能的分子机制。结果1.进展性动脉粥样硬化兔模型的建立及斑块形成评估球囊损伤组兔的颈总动脉形成了明显的粥样斑块,其内膜增生百分比、平均内膜百分比和最大内膜厚度百分比均较假手术组显著升高(P均<0.001),存在脂质核心的兔的数量亦明显多于假手术组。2.调脂通脉颗粒对兔斑块病变及ABCA1蛋白表达和胞葬作用的影响与6周模型组比较：6周中药组和6周他汀组的血清总胆固醇(TC)(P=0.027,0.012)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平(P=0.039,0.028)均明显降低,ABCA1阳性肝细胞数均明显升高(P均<0.001),颈总动脉巨噬细胞胞葬作用均明显增强(P<0.001,0.01)；6周他汀组的颈总动脉最大内膜厚度百分比明显降低(P=0.018)；12周模型组的颈总动脉巨噬细胞胞葬作用显著降低(P<0.001)。与12周模型组比较：12周中药组和12周他汀组的TC(P=0.011,0.003)和LDL-C水平(P=0.017,0.010)均显著降低,颈总动脉内膜增生百分比显著增高(P=0.001,0.022),颈总动脉(P=0.001,0.039)和胸主动脉(P=0.001,0.025)ABCA1蛋白平均光密度值均显著增加,ABCA1阳性肝细胞数均显著增加(P均<0.001),颈总动脉(P<0.001,0.021)和胸主动脉(P<0.001,0.004)巨噬细胞胞葬作用均明显增强；12周中药组的最大内膜厚度百分比明显降低(P=0.006)；12周他汀组的谷丙转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)水平均明显升高(P=0.001,0.004)。与12周他汀组比较：12周中药组的ABCA1阳性肝细胞数明显增加(P=0.001),颈总动脉巨噬细胞胞葬作用明显增强(P=0.032)。3.调脂通脉颗粒和阿托伐他汀对ApoE-l-小鼠斑块脂质自噬的影响与16周对照组比较：16周中药组和16周他汀组小鼠主动脉斑块的BODIPY和LC3共定位率以及BODIPY和LAMP1共定位率均明显增高(P均<0.001),16周他汀组小鼠主动脉组织的LC3-Ⅱ：LC3-Ⅰ蛋白含量比值、磷酸化ULK1(Thr172):总ULK1蛋白含量比值和磷酸化AMPKα(Ser317):总AMPKa蛋白含量比值均明显升高(P=0.001,0.038,0.009)。与8周对照组比较：8周他汀组的LC3-Ⅱ:L C3-Ⅰ蛋白量比值、磷酸化ULK1(Thr172):总ULK1蛋白量比值和磷酸化AMPKa(Ser317):总AMPKa蛋白量比值均显著升高(P=0.029,0.046,0.003),16周对照组的LC3-Ⅱ:L C3-Ⅰ蛋白量比值、磷酸化ULK1(Thr172):总ULK1蛋白量比值和磷酸化AMPKa(Ser317):总AMPKa蛋白量比值均明显降低(P=0.001,0.043,0.009)。结论1.在高脂饮食基础上应用球囊损伤法能够快速有效的建立明显的进展性兔动脉粥样硬化病变,较好地模拟了人类动脉粥样硬化的发生和发展过程。2.调脂通脉颗粒通过同时提高血管壁巨噬细胞和肝脏细胞的膜转运体ABCA1功能以及激活巨噬细胞的脂质自噬功能,增强了斑块巨噬细胞胞内分解胆固醇、胞膜外运并清除胆固醇的整体脂质代谢能力,减轻了胆固醇在血管壁的过度堆积,从而起到了明显的抗动脉粥样硬化作用,并且尤其在降低晚期斑块偏心性上较阿托伐他汀更具优势；同时,调脂通脉颗粒降脂作用明显且长期服用的副作用较低。3.阿托伐他汀能够通过AMPK-ULK1-LC3通路激活斑块巨噬细胞的脂质自噬,提高巨噬细胞分解胆固醇的能力,减少泡沫细胞的产生,以一种较新的方式发挥抗动脉粥样硬化的疗效。