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骨缺损、骨不连一直是困扰骨科临床医生的重要难题。随着严重骨折发生率明显增高,由其带来的骨缺损、骨不连等问题也越来越严唆。因此研究促进骨修复的机制、缩短骨折愈合时间的方法显得尤为必要。中医活血化瘀法在骨折愈合治疗中具有显著的积极作用,且前期大量实验证实活血化瘀药红花通过促进骨髓间充质干细胞迁移,进而对骨折愈合治疗具有显著效果。为探讨红花促进骨髓间充质干细胞迁移,深入研究其分子生物学机制,故本实验通过一系列筛选发现红花有效单体棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移具有显著促进作用,挑选红花有效单体棕榈酸以进一步深入研究,探讨棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移的影响作用。同时,进行相关实验研究证实棕榈酸对骨髓间充质干细胞的成骨及成软骨分化是否具有促进作用。目的:观察红花有效单体棕榈酸对骨髓间充质干细胞体外迁移、成骨分化及成软骨分化的影响作用,并深入探讨棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移及分化相关的分子生物学机制。从而为棕榈酸促进骨折愈合提供基础实验研究依据,为开发新药产品奠定基础,并申报专利。方法:1.采用全骨髓灌注法培养SD大鼠原代骨髓间充质干细胞,由于细胞贴壁生长的特性,采用贴壁筛选法不断提高细胞的纯度,取纯度高且状态良好的第3代细胞行细胞表面抗原流式检测及诱导成骨、成脂及成软骨三向分化鉴定。2.噻唑蓝(MTT)比色法检测棕榈酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响作用。3.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移相关CXCR4基因表达情况及CXCR4沉默后棕榈酸干预下CXCR4基因表达情况。4.细胞体外迁移实验(Transwell)检测棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移及CXCR4沉默后棕榈酸干预下细胞迁移的影响作用。5.免疫蛋白印迹法(Western Blot)检测棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移相关CXCR4蛋白表达情况及CXCR4沉默后棕榈酸干预下CXCR4蛋白表达情况。6.茜素红染色检测棕榈酸对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响作用。7.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测棕榈酸对骨髓间充质干细胞成骨及成软骨分化相关基因(ALP、、OPN、RUNX2、SOX9、COL2、ACAN)表达的影响作用。结果:1.细胞鉴定结果:检测细胞表面抗原标志物结果显示CD105、CD29、CD44、CD73、CD90阳性率分别为98.62%、99.20%、98.82%、98.57%,阳性率均大于95%。表达造血细胞的标志物CD34、CD45阳性率分别为0.40%、0.10%,阳性率均小于5%。同时,三向分化细胞鉴定结果:在成骨、成脂及成软骨诱导液干预下,细胞均能实现成骨分化、成脂分化及成软骨分化。由此证实,本实验所使用的细胞均为骨髓间充质干细胞。2.噻唑蓝(MTT)比色法细胞增殖结果:在棕榈酸各梯度浓度干预下,各组骨髓间充质干细胞呈现不同程度的细胞增殖,且在不同干预时间(24h、48h、72h)下,维持不同程度的增殖速度。最佳干预时间为48h,最佳浓度均为10μg/mL,增长率可达29.5%。相较空白组,棕榈酸干预下细胞增殖各实验组均有统计学意义(P<0.01)。可见,棕榈酸可促进骨髓间充质干细胞增殖。3.Transwell细胞迁移实验结果:在10h棕榈酸各梯度浓度干预下,各组骨髓间充质干细胞呈现不同程度的细胞迁移。其中,10μg/mmL浓度棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞穿膜下室细胞数量显著增多,与空白组比较,具有显著统计学差异(P<0.01)。而5μg/mL、20μg/mL浓度棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞穿膜下室细胞数量明显减少,但仍多于空白组,与空白组比较,具有显著统计学差异(P<0.01)。可见,棕榈酸对骨髓间充质干细胞迁移具有积极促进作用。4.RT-PCR基因表达量结果:在棕榈酸不同浓度梯度干预下,均可不同程度提高CXCR4的信使核糖核酸(mRNA)的表达,其中尤以10μg/mL浓度为最佳,具有显著统计学差异(P<0.01)。可见,在棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞CXCR4基因表达有显著提高。5.CXCR4沉默后RT-PCR基因表达量结果:10μg/mL棕榈酸对沉默后细胞CXCR4基因的表达具有显著促进作用,具有统计学意义(P<0.05)。可见,在棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞部分恢复CXCR4基因表达。6.CXCR4沉默后Transwell细胞迁移实验结果:10μg/mL棕榈酸对CXCR4沉默干预后的骨髓间充质干细胞迁移具有显著促进作用。棕榈酸+沉默组与空白对照组比较,不具有统计学意义(P>0.05)。而棕榈酸+沉默组与沉默组比较,P<0.01,具有显著统计学差异。可见,在棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞部分恢复细胞的迁移能力。7.Western blot免疫蛋白印迹实验结果:10μg/mL棕榈酸对CXCR4沉默干预后的骨髓间充质干细胞CXCR4蛋白表达具有显著促进作用。棕榈酸+沉默组与空白对照组比较,不具有统计学意义(P>0.05)。而棕榈酸+沉默组与沉默组比较,具有显著统计学差异(P<0.01)。可见,在棕梢酸干预下,骨髓间充质干细胞部分恢复CXCR4蛋白表达。8.棕榈酸+成骨诱导干预下,茜素红染色以及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果:与诱导组比较,棕榈酸+诱导组对骨髓间充质干细胞RUNX2基因的表达具有显著促进作用,其中尤以20μg/mL浓度最佳,具有统计学意义(P<0.05)。可见,在棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞有成骨分化的趋势。9.棕榈酸+成软骨诱导干预下逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果:与诱导组比较,棕榈酸+诱导组对骨髓间充质干细胞S0X9基因的表达具有显著促进作用,其中尤以20μg/mL浓度最佳,且与诱导组对比,具有统计学意义(P<0.05)。可见,在棕榈酸干预下,骨髓间充质干细胞有成软骨分化的趋势。结论:活血化瘀药红花的有效单体棕榈酸对骨髓间充质干细胞增殖、体外迁移及成骨、成软骨分化具有积极促进作用,进一步证实了活血化瘀法治疗骨折愈合具有显著意义,并为红花在骨折愈合治疗中提供分子生物学依据,为棕榈酸促进骨折愈合奠定基础。同时,优化以中医活血理论为基础的创新中药设计,为加快骨折愈合开辟新的治疗思路,为骨折三期辨治原则提供研究基础。