研究背景： 人口老龄化是当今世界各国家已经或即将面临的严峻社会问题，在我国这一问题将会尤为突出。截至去年底我国60岁以上的人口已达1.44亿，占总人口的11％，已进入老龄化社会。而在未来的几十年中，我国社会老龄化的推进速度将是十分迅速：预计到2014年，我国老年人口总数将突破2亿人，2026年超过3亿人，2050年将会达到近4.5亿人，占总人口的比例超过30％。随着人口的老龄化，老年痴呆的发病率日益升高。阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是老年痴呆最常见类型，我国60岁以上人群的AD年发病率为0.42％-0.95％。AD是一种中枢神经系统退行性疾病，其突出临床特征是早期出现认知功能损害并进行性加重，逐渐会引起老年人生活能力丧失并在发病后7-10年导致其死亡，给社会经济发展和家庭带来沉重的负担。 近10余年来大量病理学、遗传学和转基因动物等方面的证据表明，Aβ是引起AD的主要致病物质。由Aβ所构成的细胞外SP的沉积(老年斑，senile plaque)及细胞内NFT(neurofibrillary tangle)是AD确诊的金标准。在AD未出现临床症状之前脑内即有可溶性Aβ纤维单体形成，并逐渐聚集形成老年斑，引起一系列复杂的病理生理变化。海马在学习记忆机制中，特别是空间学习记忆发挥重要作用，是AD最易受累脑区。成年哺乳动物海马齿状回颗粒细胞下层(subergranularzone，SGZ)神经发生终生存在，与学习记忆密切相关。局部环境因素影响其神经发生。在AD早期的病理阶段脑内产生的Aβ对海马神经发生有何影响、机制如何，是近年来神经科学领域研究的热点。阐明AD早期病理阶段海马神经发生的变化及其机制，对于AD的预防和治疗十分重要。 神经营养素(neurotrophin，NT，)低亲和力的7500.NT受体(75 KD NT recep tor，p75NIR)，属1型跨膜TNF受体超家族。p75NTR在Trk存在时被活化，提高对神经营养因子的反应性。Trk受体和p75 NTR协同作用，参与神经系统发育。近年来研究表明，p75 NTR在神经发育过程中调控神经细胞存活和死亡方面发挥关键作用，同时p75 NTR作为Aβ受体，介导了Aβ诱导的神经元死亡。p75 NTR是否参与Aβ对AD脑内神经发生的影响，目前存在较大争论。 为此，本研究构建了p75NTR敲除AD小鼠模型，并通过p75NTR胞外段(p75NTR-ECD)阻断在体海马干细胞和离体培养干细胞的p75NTR激活，观察了海马NSCs神经发生的变化，从在体和离体水平探讨p75 NTR在AD海马神经发生中的作用。 方法： 1.实验动物模型的制作及鉴定 通过APPswe/PSldE9转基因AD(APPswe+/-)小鼠和p75NTR基因敲除(p75NTR-/-)小鼠(均源于美国Jackson实验室)，将p75 NTR-/-小鼠和APPswe转基因AD小鼠杂交，产生出APPswep75 NTR+/-小鼠，然后反复与p75 NTR-/-杂交10代，得到具有99.9％以上129/Sv背景的杂合型APPswep75NTR-/-小鼠；随后将APPswep75 NTR-/-小鼠与p75 NTR+/+小鼠(背景均为129/Sv)进行杂交，得到APPswep75NTR+/-小鼠；将APPSwep75NTR+/-小鼠分别和p75 NTR-/-以及p75NTR+/+小鼠杂交，最终得到了具有近100％129/Sv背景的携带不同p75NTR基因型的包括部分含有APPswe转基因的小鼠，并对成功交配繁殖后的小鼠进行了基因型鉴定。 2.p75N像基因敲除对AD小鼠海马神经发生的影响 根据动物基因型的鉴定结果，选取3、6、9月龄p75敲除AD小鼠(APPswe+/- p75NTR-/-)、AD小鼠(APPswe+/- p75NTR+/+)及野生型小鼠(APPswe-/- p75NTR+/+)作为实验鼠共9组，每组10只。采用Morris水迷宫检测各组小鼠潜伏期、游泳速度及空间探索能力的差异，腹腔注射BrdU(剂量为100ug/Kg体重，2/日，共3天)后免疫组化检测各组小鼠海马神经干细胞的增殖情况，并用免疫荧光双标(Brdu+DCX、Brdu+GFAP)结合激光共聚焦显微镜观察海马神经干细胞增生后的初步分化。 3.AD小鼠p75NTR-EcD海马注射后干细胞增殖的变化 p75NTR胞外段(Extracellular domain of p75NTR，p75NTR-ECD)是p75NTR与其配体(包括Aβ)的结合部位。选取9月龄APPswe PS1dE9 AD小鼠12只，随机分为实验组和对照组，每组各6只，采用克隆表达的人p75NTR-EcD向AD小鼠海马注射来阻断p75NTR配体激活路径，对照组注射人IgG，腹腔注射BrdU(方法同2)后免疫组化检测两组AD小鼠海马神经干细胞增殖的变化。 4.p75NTR-ECD对Aβ1-42培养海马干细胞增殖的影响 分离培养了成年小鼠(2月龄)海马神经干细胞，观察离体条件下加入Aβ42寡聚体10um/l对成年小鼠海马神经干细胞增殖的影响，然后用不同浓度人p75NTR胞外段(p75NTR-ECD)中和培养体系中的Aβ42，细胞计数测定神经干细胞的增殖变化。 结果： 1.实验小鼠基因型鉴定结果及生长情况 本实验所选用交配的两种动物即APPswe/PSldE9转基因AD小鼠和p75NTR基因敲除小鼠的遗传背景分别为C57BL/6、129/sv，将上述两种小鼠进行杂交，成功交配繁殖后对所生小鼠的基因型进行了鉴定，选择APPswe+/- p75NTR-/-为p75敲除AD小鼠，APPswe+/- p75NTR+/+为AD小鼠，APPswe-/-p75NTR+/+为野生型小鼠。各种基因型小鼠的存活率、体重、繁殖生育能力及日常行为与其他遗传背景小鼠比较无明显异常表现。 2.p75NTR基因敲除后AD小鼠海马神经发生的变化 随着月龄增加，各基因型小鼠海马神经发生均呈下降趋势，但AD鼠神经发生较野生鼠下降更为明显，同时与同月龄鼠相比增殖细胞向胶质分化比例增加、向神经元分化的比例下降，组间差别显著。通过比较不同月龄阶段同p75NTR基因型小鼠海马神经干细胞的增殖分化情况，结果表明AD小鼠在p75NTR敲除的情况下3、6、9月龄海马神经干细胞的增殖较未敲除鼠均增加，在6、9月龄鼠表现尤为显著，但增殖细胞的分化组间无明显差异。水迷宫检测显示3、6、9月龄AD小鼠的学习记忆能力与同龄野生鼠无显著差异，p75NTR基因敲除后可促进AD小鼠海马的神经发生，但行为学检测发现对此阶段AD小鼠的记忆功能无明显影响。 3.p75NTR-ECD对AD小鼠海马干细胞增殖的影响 通过向AD小鼠海马注射人p75NTR-ECD融合蛋白，观察其对海马细胞增殖的影响。结果显示注射人p75NTR-ECD融合蛋白AD小鼠海马BrdU阳性标记细胞较注射等mol量人IgG的AD小鼠明显增加，组间差异显著。 4.p75NTR-ECD对Aβ培养海马干细胞增殖中的影响 成功分离、培养了成年小鼠海马NSCs。原代培养4-5d后多数成熟细胞死亡，而表达nestin抗原的神经细胞克隆球在培养7-10d形成，进一步将神经球分离成单细胞传代培养后，仍可在无血清培养基中快速生成并保持未分化状态、而且依旧表达nestin抗原的细胞克隆球，贴壁后可向神经元或胶质分化。离体条件下Aβ1-42对海马NSCs的增殖有明显的抑制作用；而如果同时加入p75NTR-ECD胞外段后则可以阻断Aβ1-42对小鼠海马NSCs增殖的抑制作用。 结论： 1.成功构建p75NTR基因基因敲除AD小鼠模型 2.p75 NTR对AD小鼠海马神经干细胞增殖起抑制作用，对其分化无显著影响。 3.p75NTR介导了Aβ1-42对海马干细胞增殖的抑制效应。